Қатты фазаның синтезі. Пептидтердің құрылымы. Пептидтік байланыс түзілу реакциялары
Комбинаторлық синтез тек ерітіндіде (сұйық-фазалық синтез) ғана емес, сонымен қатар қатты химиялық инертті фазаның бетінде де жүргізілуі мүмкін. Бұл жағдайда бірінші бастапқы материал полимер тасымалдаушысының бетіндегі функционалдық топтарға химиялық жолмен «тігіледі» (көбінесе күрделі эфир немесе амидтік байланыс қолданылады) және екінші бастапқы материалдың ерітіндісімен өңделеді, ол реакцияның аяқталуы үшін айтарлықтай артық. Реакцияның бұл түрінде белгілі бір ыңғайлылық бар, өйткені өнімдерді оқшаулау техникасы жеңілдетілген: полимер (әдетте түйіршіктер түрінде) жай сүзіледі, екінші реагенттің қалдықтарынан мұқият жуылады және мақсатты қосылыс болып табылады. одан химиялық жолмен бөлінеді.
Органикалық химияда іс жүзінде кез келген жағдайда мақсатты өнімдердің сандық шығымдылығын қамтамасыз ететін бірде-бір реакция жоқ. Жалғыз ерекшелік оттегідегі органикалық заттардың толық жануы болып табылады жоғары температура CO 2 және H 2 O. Сондықтан мақсатты өнімді тазарту әрқашан таптырмас және көбінесе ең қиын және уақытты қажет ететін тапсырма болып табылады. Ерекше қиын міндет пептидтер синтезінің өнімдерін оқшаулау болып табылады, мысалы, полипептидтердің күрделі қоспасын бөлу. Сондықтан да пептидтік синтезде 1960 жылдардың басында Р.Б.Мерифилд әзірлеген қатты полимерлі субстратта синтездеу әдісі кеңінен қолданыла бастады.
Меррифильді әдістегі полимер тасымалдаушы - бұл полипептидтің бірінші аминқышқылының қалдығымен тіректерді байланыстыратын байланыстырғыштар болып табылатын бензол сақиналарында хлорметил топтары бар түйіршікті кросс-полистирол. Бұл топтар полимерді бензилхлоридтің функционалды аналогына айналдырады және карбоксилат аниондарымен әрекеттескенде күрделі эфирлік байланыстарды оңай түзу мүмкіндігін береді. Мұндай шайырдың N-қорғалған аминқышқылдарымен конденсациялануы сәйкес бензил эфирлерінің түзілуіне әкеледі. N-қорғауды жою полимермен ковалентті байланысқан бірінші амин қышқылының С-қорғалған туындысын береді. Босатылған амин тобының екінші амин қышқылының N-қорғалған туындысымен аминоациляциясы, одан кейін N-қорғауының жойылуы полимермен де байланысқан ұқсас дипептидті туындының пайда болуына әкеледі:
Мұндай екі сатылы цикл (депротекция – аминоациляция), негізінен, берілген ұзындықтағы полипептидтік тізбекті құру үшін қанша қажет болса, сонша рет қайталануы мүмкін.
Мерифилд идеяларының одан әрі дамуы, ең алдымен, жаңасын табуға және жасауға бағытталды полимерлі материалдарсубстраттар үшін, өнімдерді бөлу әдістерін әзірлеу және полипептидтер синтезінің бүкіл циклі үшін автоматтандырылған қондырғыларды құру
Мерифилд әдісінің тиімділігі бірқатар табиғи полипептидтердің, атап айтқанда инсулиннің сәтті синтезі арқылы көрсетілді. Әсіресе оның артықшылықтары рибонуклеаза ферментінің синтезі мысалында анық көрсетілді. Мәселен, көп күш жұмсаудың құнына бірнеше жыл бойы Хиршман және 22 қызметкер дәстүрлі сұйық фазалық әдістерді қолдана отырып, рибонуклеаза ферментінің (124 аминқышқылының қалдығы) синтезін орындады. Бір мезгілде дерлік бірдей ақуыз автоматтандырылған қатты фаза синтезі арқылы алынды. Екінші жағдайда жалпы саны 11 931 түрлі операцияны қамтитын синтез, оның ішінде 369 химиялық реакциялар, бірнеше айдың ішінде екі қатысушы (Гатт және Меррифильд) аяқтады.
Меррифильдің идеялары құруға негіз болды әртүрлі әдістерәртүрлі құрылымды полипептидтердің кітапханаларының комбинаторлық синтезі.
Осылайша 1982 жылы қатты фазадағы пептидтердің көп сатылы параллель синтезінің түпнұсқа стратегиясы ұсынылды, ол «бөлу әдісі» деп аталады ( Сызат- бөлу, бөлу) немесе «араластыру және бөлу» әдісі (3-сурет). Оның мәні келесідей. Айталық, үш амин қышқылынан (A, B және C) трипептидтердің барлық мүмкін комбинацияларын алу керек. Ол үшін қатты полимер тасымалдаушының (Р) түйіршіктері бірдей үш бөлікке бөлініп, аминқышқылдарының бірінің ерітіндісімен өңделеді. Бұл жағдайда барлық амин қышқылдары олардың функционалды топтарының бірі арқылы полимердің бетіне химиялық байланысқан. Алынған үш сортты полимерлер мұқият араластырылады, ал қоспа қайтадан үш бөлікке бөлінеді. Содан кейін бірдей мөлшерде барлық үш аминқышқылдары бар әрбір бөлік қайтадан бірдей үш амин қышқылының бірімен өңделеді және тоғыз дипептид алынады (әрқайсысында үш өнімнің үш қоспасы). Тағы бір араластыру, үш тең бөлікке бөлу және аминқышқылдарымен өңдеу тоғыз сатыда қалаған 27 трипептидті (тоғыз өнімнің үш қоспасы) береді, ал оларды бөлек алу 27 × 3 = 81 кезең синтезін қажет етеді.
Қатты фазалық синтез немесе қатты фазалық технология, оны көбінесе керамика деп атайды, ғылым мен өндірістің әртүрлі салаларына бейорганикалық материалдарды өндіруде ең кең таралған. Оларға ядролық отын, ғарыш техникасына арналған материалдар, радиоэлектроника, приборлар, катализаторлар, отқа төзімді материалдар, жоғары температуралы асқын өткізгіштер, жартылай өткізгіштер, ферро- және пьезоэлектриктер, магниттер, әртүрлі композиттер және тағы басқалар жатады.
Қатты фазалық синтез реакцияға түсетін заттардың кем дегенде біреуі қатты дене түрінде болатын химиялық реакцияларға негізделген. Мұндай реакциялар гетерогенді немесе қатты фаза деп аталады. Қатты фазалық әрекеттесу, сұйық немесе газ тәрізді ортадағы реакциялардан айырмашылығы, екі іргелі процестен тұрады: химиялық реакцияның өзінен және заттың реакция аймағына өтуінен.
Кристаллдық компоненттер қатысатын қатты күйдегі реакциялар олардың атомдарының немесе иондарының шектеулі қозғалғыштығымен және көптеген факторларға күрделі тәуелділігімен сипатталады. Оларға реакцияға түсетін қатты заттардың химиялық құрылымы және олармен байланысты реактивтілігі, ақаулардың табиғаты мен концентрациясы, бетінің күйі мен реакция аймағының морфологиясы, әрекеттесетін реагенттердің жанасу аймағы, алдын ала механикалық химиялық активтену және бірқатар басқалар. Жоғарыда айтылғандардың барлығы гетерогенді реакциялардың механизмдерінің күрделілігін анықтайды. Гетерогенді реакцияларды зерттеу қатты денелер химиясына, химиялық физика мен қатты денелер бетінің физикалық химиясына, термодинамика мен кинетика заңдарына негізделген.
Көбінесе қатты денелік реакциялардың механизмі уақыт функциясы ретінде өзара әрекеттесу дәрежесі туралы тәжірибелік деректер кез келген нақты кинетикалық модельмен және сәйкес кинетикалық теңдеумен жақсы сипатталған негізінде ғана бағаланады. Бұл тәсіл дұрыс емес тұжырымдарға әкелуі мүмкін.
Қатты күйдегі материалдардағы процестердің сұйықтықтардағы немесе газдардағы процестерден бірқатар маңызды айырмашылықтары бар. Бұл айырмашылықтар, ең алдымен, жүйедегі компоненттердің концентрациясын орташалауды болдырмайтын және осылайша болып жатқан процестердің кеңістіктік локализациясына әкелетін қатты денелердегі диффузияның айтарлықтай (бірнеше реттік) төмен жылдамдығымен байланысты. Кеңістіктік локализация, өз кезегінде, процестердің байқалатын кинетикасына процестің меншікті жылдамдығы (немесе диффузия коэффициенті) де, реакция аймағының геометриясы да ықпал ететініне әкеледі. Геометриялық факторлармен анықталатын қатты фазалық процестердің мұндай ерекшеліктері топохимиялық деп аталады. Сонымен қатар, талқыланатын түрлендірулер кеңістікте локализацияланған болғандықтан, олардың жылдамдығын фазалық шекарадағы процестердің өзімен де (реакцияны бақылау) және осы интерфейске кез келген құрамдас бөліктің жеткізілу жылдамдығымен немесе өнімді жою жылдамдығымен анықтауға болады ( с) (диффузияны бақылау). Модельдік жорамалдар қанағаттандырылатын қарапайым жүйелер үшін бұл жағдайларды түрлендіру дәрежесінің уақытқа тәуелділік нысаны арқылы тәжірибе жүзінде анықтауға болады. Қатты денелердегі фазалық өзгерістердің тағы бір ерекшелігі қатты матрицада жаңа фазалық ядроның пайда болуы соңғыларында серпімді кернеулердің пайда болуымен байланысты, кейбір жағдайларда термодинамиканы қарастыру кезінде олардың энергиясын ескеру қажет. осы түрлендірулердің.
Қатты фазалық процестердің кинетикасына және осы жолмен алынған материалдардың микроқұрылымына әсер ететін факторлардың көптігі де осы процестердің жіктелу түрлерінің көптігін анықтайды. Осылайша, жүйенің әр түрлі типтегі тербелістерге қатысты тұрақтылығын қарастыра отырып, гетерогенді (жұмған көлемнің кішігірім ауытқуларына тұрақты және үлкенге тұрақсыз жүйелер жағдайында) және біртекті (тұрақсыз жүйелер жағдайында) шағын тербелістерге дейін) процестер ажыратылады. Мысал ретінде гетерогенді процестер үшін ядролардың түзілу және өсу механизмі бойынша жүретін трансформацияларды, біртекті процестер үшін кейбір ретті-реттік ауысуларды және қатты ерітінділердің спинодтық ыдырауын келтіруге болады.
Гетерогенді және гомогенді нуклеацияны гетерогенді процестер жағдайында гетерогенді және біртекті процестерден ажырату қажет. Гетерогенді нуклеация деп құрылымдық ақаулардағы (соның ішінде нүктелік ақаулар, дислокациялар және фазалар шекаралары) ядролардың түзілуін айтады; гомогенді нуклеация – қатты фазаның ақаусыз көлемінде ядролардың түзілуі.
Қатты фазалы түрлендіру өнімін талдай отырып, бірфазалы және көпфазалы ядроларды ажыратады. Көпфазалы ядролар жағдайында процесс өнімі қалыптасқан фазалар шекарасының беттік энергиясымен анықталатын тән микроқұрылымы бар көпфазалы колония болып табылады; бір фазалы ядролардың түзілу және өсу жағдайындағы үздіксіз процестерден айырмашылығы бұл түрдегі процестер үзіліссіз деп аталады.
Қатты фазалық түрлендірулерді жіктеудің тағы бір тәсілі бастапқы фазаның құрамы мен реакция өнімінің құрамын салыстыруға негізделген. Егер олар сәйкес келсе, олар диффузиясыз процестер туралы айтады, ал егер құрамы өзгерсе, олар диффузия туралы айтады. Сонымен қатар, диффузиялық емес процестерден бастапқы фазаның үлкен көлемдегі атомдардың бір уақытта аздап ығысуы арқылы болатын кооперативтік процестерді (мысалы, мартенситті түрлендіру) ажырату пайдалы.
Диффузиясыз фазалық түрлендірулер процесс барысында өзгеретін термодинамикалық сипаттамаларының түріне қарай әр түрлі болуы мүмкін.
Бірінші түрдегі түрлендірулер – температураға немесе қысымға қатысты химиялық потенциалдың туындыларының өзгерісі болатын процестер. Бұл энтропия, көлем, энтальпия және ішкі энергия сияқты термодинамикалық параметрлердің фазалық ауысуы кезінде күрт өзгеруін білдіреді. Екінші түрдегі түрлендірулер кезінде интенсивті параметрлерге қатысты химиялық потенциалдың бірінші туындылары өзгермейді, бірақ жоғары дәрежелі туындылар өзгереді (екіншіден бастап). Бұл процестерде жүйенің үздіксіз энтропиясы мен көлемі кезінде Гиббс энергиясының екінші туындыларымен өрнектелетін шамалардың күрт өзгеруі байқалады: жылу сыйымдылығы, жылулық кеңею коэффициенті, сығылу және т.б.
Екі фаза арасындағы қатты фазалық реакциялар (үш немесе одан да көп фазалар арасындағы байланыстар екіталай және сәйкес процестерді бірнеше екі фазалы реакциялардың комбинациясы ретінде көрсетуге болады) диффузиялық процестер болып табылады және гетерогенді немесе біртекті ядролануы бар гетерогенді немесе біртекті болуы мүмкін. . Мұндай реакциялардағы біртекті процестер мен біртекті ядроланатын процестер, мысалы, оның кейінгі ыдырауымен (ішкі реакциялар деп аталатын) метастабилді қатты ерітінді түзілген жағдайда мүмкін болады. Мұндай процестердің мысалы ішкі тотығу болуы мүмкін.
Қатты дене түрлендіруіндегі термодинамикалық тепе-теңдік шарты, кез келген басқа химиялық түрлендірулердегі сияқты, бастапқы материалдардағы және реакция өнімдеріндегі компоненттердің химиялық потенциалдарының теңдігі болып табылады. Екі қатты фазаның өзара әрекеттесуінде химиялық потенциалдардың көрсетілген теңдігі жүзеге асуы мүмкін әртүрлі жолдар: 1) қатты ерітінділердің түзілуімен бастапқы фазалардағы компоненттерді қайта бөлу; 2) басқа кристалдық құрылымы бар жаңа фазалардың пайда болуы (бұл әдетте қатты фазалық реакция деп аталады) және көпфазалы жүйенің әртүрлі фазаларындағы компоненттің химиялық потенциалы оның мөлшеріне байланысты емес әрбір фазада тепе-теңдікке қол жеткізуге болады толық түрлендірубастапқы фазалар. Қатты фазалық реакциялардың механизмі туралы ең сенімді ақпарат кешенді қолдану арқылы алынады, бұл бір уақытта реакцияға түсетін жүйенің бірнеше параметрлерін, соның ішінде фазалық құрамды, жылу эффектілерін, массалық өзгерістерді және т.б. бақылауға мүмкіндік береді.
Қатты денелік реакциялардың термодинамикалық теориясын Вагнер ұсынып, одан әрі Шмальзрид қосу реакцияларының мысалында дамытты.
Бүгінгі күнге дейін гетерогенді реакциялардың алуан түрлілігінің бірыңғай классификациясы жоқ. Бұл мұндай әмбебап классификацияның негізі ретінде критерийді таңдаудың қиындығына байланысты. Химиялық критерийлер бойынша реакциялар тотығу, тотықсыздану, ыдырау, біріктіру, алмасу және т.б. реакцияларға бөлінеді. Көрсетілген критериймен қатар реагенттердің физикалық күйінің негізгі критерийі ретінде кеңінен қолданылады:
Барлық гетерогенді реакцияларға тән қасиет реакция аймағының фазалық шекарасында болуы және локализациясы болып табылады. Реакция аймағы, әдетте, аз қалыңдықтағы әртүрлі құрамдағы заттар алып жатқан кеңістіктің екі аймағын бөледі. әртүрлі қасиеттер. Реакция аймағының пайда болу себептері әдетте екі топқа бөлінеді: диффузиялық процестердің салыстырмалы баяулығы және химиялық себептер. Соңғы топ қатты реагенттің бетінде немесе бар екі фаза арасындағы интерфейсте орналасқан атомдардың немесе молекулалардың жоғары реактивтілігіне байланысты. Қатты немесе сұйық заттың бетінде жинақы үлгінің көлемдік қасиеттерінен ерекшеленетін қасиеттер болатыны белгілі. Бұл интерфейс сипаттарын ерекше етеді. Дәл осы жерде кристалдық қаптаманың айтарлықтай қайта орналасуы орын алады, екі кристалдық тор арасындағы кернеулер азаяды және химиялық құрамы өзгереді.
Масса алмасу диффузия арқылы жүзеге асырылатындықтан, ал қатты бөлшектердің диффузиялық қозғалғыштығы оның құрылымының ақаулығына байланысты, қатты фазалық реакциялардың механизмі мен кинетикасына ақаулардың айтарлықтай әсерін күтуге болады. Бұл кезең фазааралық интерфейстегі әрекеттесуші заттардың түрленуінің химиялық кезеңінен бұрын болады. Сонымен, гетерогенді реакциялардың кинетикасы химиялық реакцияның жүруінің табиғатымен де, затты реакция аймағына жеткізу әдісімен де анықталады. Жоғарыда айтылғандарға сәйкес реакциялардың жылдамдығы химиялық кезеңмен (химиялық кинетика) немесе диффузиямен (диффузия кинетикасы) шектелетін болады. Мұндай құбылыс шындықта байқалады.
Вагнердің пікірінше, қатты денелердегі диффузия және, демек, реакция негізінен тордың тепе-теңдіксіз күйіне байланысты иондар мен электрондардың қозғалғыштығына байланысты жүзеге асады. Оның ішінде тордың әртүрлі иондары әртүрлі жылдамдықпен қозғалады. Атап айтқанда, көп жағдайда аниондардың қозғалғыштығы катиондардың қозғалғыштығымен салыстырғанда шамалы. Сондықтан қатты денелердегі диффузия және сәйкесінше реакция катиондардың қозғалысы есебінен жүзеге асады. Бұл жағдайда айырмашылығы катиондардың диффузиясы бір бағытта немесе бір-біріне қарай жүруі мүмкін. Әртүрлі зарядталған катиондар жағдайында электрондардың қозғалысына байланысты жүйенің электронды бейтараптығы сақталады. Әртүрлі зарядталған катиондардың қозғалыс жылдамдығының айырмашылығына байланысты жүйеде электрлік потенциал пайда болады. Нәтижесінде көбірек қозғалмалы иондардың қозғалыс жылдамдығы төмендейді және керісінше, аз қозғалатындар үшін? артады. Осылайша, пайда болған электрлік потенциал иондардың диффузия жылдамдығын реттейді. Соңғысы және онымен анықталатын бүкіл қатты дене түрлендіру процесінің жылдамдығы электронды өткізгіштік пен тасымалдау сандары негізінде есептелуі мүмкін. Иондардың бағытталған диффузиясы тек мынада ғана мүмкін болатыны анық электр өрісінемесе жүйеде концентрация градиенті болса.
Қатты күйдегі заттарды синтездеу кезінде көбінесе алынған өнімнің химиялық (элементтік және фазалық) құрамын ғана емес, оның микроқұрылымдық ұйымын да бақылау қажет. Бұл әртүрлі иерархиялық деңгейде қатты дененің құрылымдық ұйымының сипаттамаларына химиялық (мысалы, қатты фазалық реакциялардағы белсенділік) және көптеген физикалық (магниттік, электрлік, оптикалық және т.б.) қасиеттердің күшті тәуелділігіне байланысты. Бұл деңгейлердің біріншісіне қатты дененің элементтік құрамы және элементтер атомдарының кеңістікте өзара орналасу әдісі - кристалдық құрылым (немесе аморфты қатты денелердегі атомдардың ең жақын координациялық ортасының ерекшеліктері), сондай-ақ құрамы мен нүктелік ақаулардың концентрациясы. Қатты дене құрылымының келесі деңгейі ретінде атомдардың орналасуында трансляциялық симметрия байқалатын (нүктелік ақаулардың болуы үшін түзетілген) аймақтардың өлшемдерін анықтайтын кристалдағы кеңейтілген ақаулардың таралуын қарастыруға болады. . Мұндай аймақтарды тамаша микрокристалдар деп санауға болады және оларды когерентті шашырау аймақтары деп атайды. Когерентті шашырау аймақтары туралы айтатын болсақ, олар жалпы жағдайда қатты фазалық материалды құрайтын ықшам бөлшектерге баламалы емес екенін есте ұстаған жөн, оларда ұзартылған ақаулардың айтарлықтай саны болуы мүмкін, және, тиісінше, когерентті аймақтар. шашырау. Бөлшектермен когерентті шашырау аймақтарының сәйкес келуі (бұл жағдайда олар бір домен деп аталады) әдетте соңғысының жеткілікті кішкентай (100 нм-ден аз) өлшемдері үшін ғана байқалады. Кейінгі құрылымдық деңгейлер ұнтақты немесе керамикалық материалды құрайтын бөлшектердің пішіні мен өлшемдерінің таралуымен, олардың бірігуімен, бастапқы толтырғыштарды біріктіруімен және т.б.
Қатты фазалық материалдардың әртүрлі қолданылуы жоғарыда аталған құрылымдық сипаттамаларға әртүрлі, жиі қарама-қайшы талаптарға ие, сондықтан әртүрлі синтетикалық әдістерді қажет етеді. Сондықтан қатты фазалы заттарды емес, қатты фазалық материалдарды синтездеу әдістері туралы айту және әр жағдайда алынған өнімді кейіннен қолдану саласын ескере отырып синтез әдісін таңдау дұрысырақ.
Жалпы жағдайда қатты фазалық материалдарды синтездеу әдістерін қолданылатын химиялық процестер ағынының термодинамикалық тепе-теңдік шарттарынан қашықтығына қарай жіктеуге болады. Жалпы заңдылықтарға сәйкес, тепе-теңдіктен мүмкіндігінше алыс күйге сәйкес келетін жағдайларда түзілген ядролардың өсу жылдамдығынан ядролану жылдамдығының айтарлықтай асып кетуі байқалады, бұл ең дисперсті өнімді алуға әкеледі. Процесті термодинамикалық тепе-теңдікке жақын жүргізген жағдайда бұрыннан түзілген ядролардың өсуі жаңалардың пайда болуына қарағанда тезірек жүреді, бұл өз кезегінде ірі түйіршікті (шектеулі жағдайда, бір кристалды) материалдарды алуға мүмкіндік береді. Кристалдардың өсу қарқыны да көп жағдайда олардағы ұзартылған (тепе-теңдік емес) ақаулардың концентрациясымен анықталады.
Қатты фазалық синтез болашақ олигомердің бірінші буынының «зәкір» тобына H. ковалентті түрде бекітілгеніне негізделген, тізбекті ұзарту ерітінділерде синтез үшін қолданылатын әдеттегі схемалар бойынша стандартты қорғалған мономерлермен жүзеге асырылады. Қорытындылау. синтез кезеңі. олигомер N.-дан бөлініп, тиісті әдістермен тазартылады. Негізінде қатты фазалық синтез қолданылады. полипептидтерді, олигонуклеотидтерді және олигосахаридтерді алу.
N. naib ретінде полипептидтердің синтезі кезінде. стиролдың және 1-2% дивинилбензолдың сополимері кеңінен қолданылады, C-соңғы жағында бірінші амин қышқылын (қорғалған N H 2 тобымен) бекіту үшін диметоксибензилхлоридті анкерлік топты енгізу арқылы модификацияланады, мысалы:
N-қорғаныш тобы жойылғаннан кейін полипептидтік тізбектің ұзаруы ерітіндідегі пептидтер синтезінің стандартты әдістерімен жүзеге асырылады (Пептидтерді қараңыз). Конденсациялаушы агенттер ретінде, Наиб. карбодиимидтер жиі қолданылады немесе аминқышқылдары алдын ала активаторға айналады. эфирлер.
Олигонуклеотидтер синтезінде нуклеин қышқылдары ретінде макрокеуекті шынылар немесе силикагель қолданылады. Анкерлік топ N. spec бөлінген карбоксил тобы болып табылады. «аяқ», мысалы:
В-пуриндік немесе пиримидтік негіз
Бірінші кезеңде нуклеозид тасымалдаушыға дезоксирибозаның 3 «-гидроксил тобында бекітіледі, ондағы 5 позициядағы гидроксил тобы» диметокситритил тобымен (CH 3 OS 6 H 4) 2 (C 6 H) қорғалған. 5) C (DMTr ); оның бөлінгеннен кейінгі мөлшері спектрофотометриялық жолмен оңай өлшенеді, ол шама ретінде қызмет етеді. тасымалдаушының жүктелуіне тән және олигонуклеотидтер тізбегін құрудың келесі кезеңдеріндегі шығымдылықты бағалауға мүмкіндік береді. DMTr тобын алып тастағаннан кейін тізбек фосфитамидтерді (ф. I; М. Капосерс, 1980) немесе фосфонаттарды (гидрофосфонаттар) қолдану арқылы жиналады (II; Р. Стремберг, 1986):
Қатты фазалық синтезді жүзеге асыру үшін ауданның әр кезеңінде жоғары өнім (96-99% деңгейінде) қажет, сонымен қатар тиімді әдістерсинтезделгенді тазарту және оқшаулау. байланыстар.
Қатты фазаны қолдану олигомер тізбегінің өсуінің әрбір кезеңін айтарлықтай жеңілдетуге және тездетуге мүмкіндік береді, өйткені ерітіндідегі артық компоненттерді, конденсациялаушы агенттерді және жанама өнімдерді бөлу реакцияларды сүзу арқылы жүзеге асырылады. қоспалар және N. қолайлы ерітінділер жиынтығымен жуу. Осылайша, олигомер тізбегін құрастыру процесі бірқатар стандартты операцияларға бөлінеді: тізбектің өсіп келе жатқан ұшын блоктау, келесі қорғалған мономер мен конденсаторды мөлшерлеу, осы қоспаны есептелген уақыт ішінде N. бағанасына беру және жуу. сәйкес еріткішпен N. Мономерлі буынның түзілу циклі b. автоматтандырылған.
Автоматтың жүрегінде бітіру кеші. синтездер жиі кездеседі электр схемасы(суретті қараңыз). Көптеген синтезатор модельдері колонналардың дизайнымен және олардың санымен, реагенттер мен еріткіштерді беру әдісімен және т.б. ерекшеленеді. Басқару және бағдарламалау кірістірілген немесе қашықтағы компьютердің көмегімен жүзеге асырылады.
Автоматты құрылғының принциптік схемасы. бітіру кеші. синтезаторлар (электрлік басқару сызығы нүктелі сызықпен белгіленеді): 1 - мономерлерді (M 1 , M n) және конденсаторды (КА) жеткізу желісі; Реагенттерді (мысалы, тотықтырғыштар, ацилдендіргіштер, to-t және т.б.) және p-еріткіштерді (P 1 , P n) жеткізуге арналған 2-жол; 3 - коммутациялық клапандар; 4-бағаналы тасушы, таратумен жабдықталған. клапан; 5-фотометриялық жасуша; 6 метр; 7-басқару және бағдарламалау блогы; 8-дисплей.
Қатты фазалық синтездің әлеуеті сәйкесінше ұзындығы 124 және 183 аминқышқылдарынан тұратын рибонуклеаза А (Р. Меррифилд, 1969) және адамның өсу гормоны (Д. Ямаширо, 1970) синтезі арқылы көрсетілді. Дегенмен, пептидтік байланыстың түзілуі кезінде пайда болатын шағын, бірақ тұрақты рацемизацияға байланысты синтезатор. белоктардың биолы төмен. белсенділік, сондықтан автоматты. синтезаторларды Ч. Арр. қысқа полипептидтерді (10-30 буын) алу үшін, оның ішінде препарат үшін
Өнертабыс H-D--Nal--Thr-NH 2 формуласының пептидін синтездеуге арналған қатты фазалық әдіске қатысты, онда Boc-қорғалған және Fmoc-қорғалған амин қышқылдары мен хлорметилденген полистирол шайыры қолданылады. 10 z.p. f-ly.
Өнертабыс жататын технология саласы
Осы өнертабыс құрамында үш немесе одан да көп аминқышқылдарының қалдықтары бар, N-соңғы аминқышқылы, N-соңғы амин қышқылына іргелес соңғы соңғы амин қышқылы және C-соңғы амин қышқылы бар пептидті дайындау әдісіне қатысты.
Бапқа дейінгі
Қатты фазалық пептидтердің синтезі 1963 жылы пептидтердің ерітінді синтезімен байланысты аралық тазарту қадамдарының көптеген мәселелерін жеңу үшін енгізілді (Stewart et. al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2-ші басылым, 1984). Қатты фазалық синтезде амин қышқылдары кез келген қажетті ретпен пептидке жиналады (мысалы, біріктіріледі), ал тізбектің бір ұшы (мысалы, С-терминусы) ерімейтін тасымалдаушыға бекітіледі. Қажетті реттілік тасымалдаушыға (тірек) жиналғаннан кейін, пептид тасымалдаушыдан босатылады (яғни үзіледі). Байланысқан аминқышқылдарының α-амин топтары үшін екі стандартты қорғау тобы күшті қышқылмен жойылатын Boc және негізмен жойылатын Fmoc болып табылады. Осы өнертабыс хлорметилденген полистиролдан жасалған арзан шайырға бір синтезде α-амин топтары үшін осы екі қорғаныстың комбинациясын пайдалана отырып, пептидтерді өндірудің ыңғайлы әдісіне қатысты.
Жоғарыда аталған α-аминоқорғау схемаларының кез келгенін пайдалана отырып, қатты фазалық пептидтердің синтезін жобалау кезінде пептидті құрайтын аминқышқылдарының кез келген реактивті «жүйірлік топтары» тізбекті құрастыру кезінде қажетсіз химиялық реакциялардан қорғалғаны маңызды. Әртүрлі бүйірлік топтарды қорғау үшін таңдалған химиялық топтардың β-амин топтарын қорғауды жою үшін қолданылатын реагенттермен жойылмағаны да жөн. Үшіншіден, өсіп келе жатқан пептидтік тізбектің шайыр бөлшектерімен байланысы α-аминоқорғаныстың кез келген түрін жою үшін тізбекті құрастыру процесінде қолданылатын реагенттерге төзімді болуы маңызды. Fmoc қолданатын α-аминді қорғау схемасы жағдайында бүйірлік топтың қорғанысы Fmoc жою үшін қолданылатын сілтілі реагенттерге төзімді болуы керек. Іс жүзінде бұл бүйірлік тізбекті қорғау топтары әдетте пептидтік тізбекті құрастыру аяқталғаннан кейін жұмсақ қышқылды реагенттермен жойылады. Егер Boc көмегімен β-амин тобын қорғау схемасы пайдаланылса, бүйірлік топ қорғанысы әрбір циклде Boc тобын жою үшін пайдаланылатын әлсіз қышқыл реагентке төзімді болуы керек. Іс жүзінде, Boc көмегімен β-аминді қорғау схемасындағы бұл бүйірлік тізбекті қорғау топтары әдетте пептидтік тізбекті құрастыру аяқталғаннан кейін сусыз HF көмегімен жойылады. Осылайша, іс жүзінде Fmoc бар α-аминді қорғау схемасында жиі қолданылатын бүйірлік тізбекті қорғау топтары α-амин топтарын Boc-пен қорғауды жою үшін қолданылатын жағдайларда тұрақты емес. Сондықтан қатты фазалық пептидтік синтезде пептидтік тізбекті құрастыру кезінде α-амин топтарын қорғау схемаларының екі түрі біріктірілмейді. Сонымен қатар, пептидтік синтезде қолданылатын ең арзан полимерлі шайыр (хлорметилденген полистирол немесе «Мэрифилд шайыры») Boc топтарымен қорғалған аминқышқылдарымен бірге кеңінен қолданылғанымен, әдебиеттерде қорғаныс жағдайында қолдануға болмайды деген қорытынды жасалған. α-аминотоптарының Fmoc топтары сілтілі жағдайларда тұрақсыздығына байланысты (қараңыз: Stewart et. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2-ші басылым, 1984). Осы өнертабыс Мерифилд шайырында Boc-қорғалған және Fmoc-қорғалған аминқышқылдарының қатты фазалық синтезінде белгілі пептидтерді бірге қолдану әдісіне бағытталған.
Соматостатиннің аналогы болып табылатын Ланреотид® өсу гормонының бөлінуін тежейтіні, сондай-ақ инсулинді, глюкагонды және ұйқы безінің экзокринді секрециясын тежейтіні белгілі.
АҚШ патенті № 4,853,371 Lanreotide®, оны дайындау процесі және өсу гормонының, инсулиннің, глюкагонның және экзокринді ұйқы безінің секрециясының секрециясын тежеу әдісін ашады және мәлімдейді.
АҚШ патенті № 5147856 рестенозды емдеу үшін Ланреотидті® қолдануды ашады.
АҚШ патенті № 5411943 гепатоманы емдеу үшін Ланреотидті® қолдануды ашады.
АҚШ патенті № 5073541 өкпе обырын емдеу үшін Lanreotide® қолдануды ашады.
1993 жылғы 9 шілдеде берілген АҚШ патентінің № 08/089410 өтінімі меланоманы емдеу үшін Ланреотид® препаратын қолдануды ашады.
№ 5 504 069 АҚШ патенті қатты ісіктердің жедел өсуін тежеу үшін Ланреотидті® қолдануды ашады.
1997 жылы 13 мамырда берілген АҚШ патенттік өтінімі № 08/854941 салмақ жоғалту үшін Ланреотид® препаратын қолдануды ашады.
1997 жылғы 13 мамырда берілген АҚШ патенттік өтінімі № 08/854,943 инсулинге төзімділікті және Х синдромын емдеу үшін Ланреотидті® қолдануды ашады.
АҚШ патенті № 5688418 ұйқы безі жасушаларының өміршеңдігін ұзарту үшін Lanreotide® қолдануды ашады.
РСТ өтініші № PCT/US 97/14154 фиброзды емдеу үшін Ланреотидті® қолдануды ашады.
1997 жылғы 13 мамырда берілген АҚШ патенттік өтінімі № 08/855311 гиперлипидемияны емдеу үшін Ланреотидті® қолдануды ашады.
1995 жылғы 12 мамырда берілген АҚШ патентінің № 08/440061 өтінімі гиперамилинемияны емдеу үшін Ланреотидті® қолдануды ашады.
1997 жылғы 7 мамырда берілген АҚШ патентінің № 08/852221 өтінімі гиперпролактинемия мен пролактиномаларды емдеу үшін Ланреотидті® қолдануды ашады.
Өнертабыстың мәні
Осы өнертабыс құрамында үш немесе одан да көп аминқышқылдарының қалдықтары бар, N-соңғы аминқышқылы, N-соңғы аминқышқылына іргелес соңғы соңғы амин қышқылы және С-соңғы аминқышқылы бар пептидті дайындау әдісін ұсынады, аталған әдіс мыналарды қамтиды: келесі қадамдар:
(а) бірінші амин қышқылын қатты тірек шайырға эфирлік байланыс арқылы қосу, оның құрамына (i) цезий тұзын түзу үшін цезий карбонатының судағы ерітіндісін бірінші амин қышқылының спирттік ерітіндісімен әрекеттесу кіреді. бірінші амин қышқылының, (іі) бірінші амин қышқылының еріткішсіз цезий тұзын алу, (iii) қатты тірек шайырын құрғақ (сусыз) полярлы апротикалық еріткіште бірінші амин қышқылының цезий тұзымен әрекеттесуі бірінші қосымша өнім,
мұндағы бірінші амин қышқылы пептидтің С-соңғы амин қышқылына сәйкес келсе, бірінші амин қышқылының бүйірлік емес (негізгі) тізбегінің амин тобы Boc арқылы блокталады, ал бірінші аминқышқылында функционалдық топ болмайды. қорғауды қажет ететін бүйірлік тізбекте, ал қатты тірек - шайыр - хлорметиляцияланған полистирол шайыры;
(b) бірінші қосылудың блоктан шығарылған өнімін қалыптастыру үшін қышқылмен бірінші қосылу өнімінен Boc қорғанысын жою (блоктан шығару);
(c) қалауы бойынша келесі аминқышқылын блокталған (қорғалған) келесі тіркеме өнім алу үшін құрамында пептидті өсіретін реагент бар органикалық еріткіште блоктан шығарылған бірінші тіркеме өніммен әрекеттесуді қамтитын келесі амин қышқылын бекіту, онда келесі амин қышқылының негізгі тізбегінде Boc арқылы блокталған амин тобы бар, ал егер келесі амин қышқылының бүйірлік тізбегінде бір немесе бірнеше функционалды топтар болса, онда бүйірлік тізбектегі функционалдық топтар қорғанысты қажет етпейді немесе функционалдық топтар бүйірлік тізбекте қорғанысты жою үшін қолданылатын қышқыл немесе сілтілі реагенттерге төзімді қорғаныс топтары бар, тиісінше, Boc және Fmoc;
(d) қорғалмаған келесі қосындыны алу үшін блокталған келесі қосымшаны қышқылмен әрекеттестіруді қамтитын блокталған келесі қосымшадан Boc қорғанысын жою;
(e) таңдау бойынша (c) және (d) қадамдары қайталанады, әрбір цикл келесі (X+1)-ші қосымшаның босатылған өнімін жасайды, мұнда X - циклдің қажетті қайталануының саны;
(f) келесі амин қышқылын (b)-қадамындағы босатылған бірінші тіркеме өнімге немесе, таңдау бойынша, (e) қадамынан босатылған (X+1) келесі қосымша өнімге қосу, бұл келесі амин қышқылын аталғанмен әрекеттесуді қамтиды. бірінші тіркеме өнімі немесе блокталған (Х+1)-ші қосымшаның көрсетілген бұғатталған өнімімен пептидті өсіруге арналған реагент бар органикалық еріткіште блокталған (қорғалған) келесі тіркеме өнімді алу үшін, ал келесі амин қышқылының негізгі тізбегі бар келесі амин қышқылының бүйірлік тізбекте бір немесе бірнеше функционалдық топтары болса, онда бүйірлік тізбектегі функционалдық топтар қорғауды қажет етпейтін немесе бүйірлік тізбектегі функционалдық топтардың қорғаныш топтары болған жағдайда Fmoc блоктаған амин тобы. Fmoc қорғанысын жою үшін қолданылатын сілтілі реагенттерге төзімді;
(g) қорғалмаған келесі қосындыны алу үшін блокталған келесі қосымшаны негізгі немесе қайталама аминмен әрекеттесуді қамтитын блокталған келесі қосымшадан Fmoc қорғанысын жою;
(h) таңдау бойынша (e) және (g) қадамдарды қайталау, әрбір цикл келесі (X+1)-ші қосудың бұғатталған өнімін генерациялайды, мұндағы X - соңғыдан кейінгіге дейін циклдің қажетті қайталану саны. пептидке және блокталған амин қышқылына кіреді;
(i) N-терминалды амин қышқылын қорғалмаған (X+1)-ші келесі қосылу өніміне қосу, оған N-терминал амин қышқылын қорғалмаған (X+1) келесі қосылу өнімімен органикалық еріткіште әрекеттестіру кіреді. пептидті өсіретін реагент, бұғатталған түпкілікті өнімді алу үшін, онда N-терминал амин қышқылы Boc немесе Fmoc арқылы блокталған негізгі амин тобы бар;
(j) шайырда аяқталған пептидтік өнімді қалыптастыру үшін блокталған аяқталған қоспа өнімін Boc жағдайында қышқылмен немесе Fmoc жағдайында негізмен әрекеттесуді қамтитын блокталған аяқталған қоспа өнімінен Boc немесе Fmoc қорғанысын жою;
(j) егер шайырдағы аяқталған пептидті өнімде бүйірлік тізбектің функционалдық топтары болса, онда дайын пептидті өнім алу үшін шайырдағы аяқталған пептидті өнімді тиісті қорғанысты жоюға арналған реагенттермен әрекеттесуді қамтитын шайырдағы аяқталған пептидтік өнімнің бүйірлік тізбектің функционалдық топтарын қорғауды жою. шайырдағы аяқталған пептидті өнім қорғаныс жойылды; Және
(k) дайын пептидтік өнімді шайырдағы немесе қорғалмаған шайырдағы аяқталған пептидті өнімді аммиакпен әрекеттесуді қамтитын пептидті алу үшін дайын пептидті өнімнің шайырдағы немесе қорғалмаған шайырдағы аяқталған пептидті өнімнің қатты шайыр тасымалдаушысынан пептидті бөлу. , пептидтің шайырдан бөлінуінің практикалық аяқталуына дейін біріншілік немесе екіншілік амин;
пептид синтезіндегі (e) және (g) қадамдары кемінде бір рет орындалуы керек деген шартпен.
Осы өнертабысқа сәйкес процесс артықшылықты болып табылады, мұнда аммиак, біріншілік амин немесе (k) қадамындағы екінші амин спирті және міндетті түрде апротикалық полярлы еріткіші бар еріткіште болады,
Осы өнертабысқа сәйкес әдіс артықшылықты болып табылады, мұнда (l) қадам одан әрі келесі қадамдарды қамтиды:
еріткіштен бөлінген пептидтің тұнбаға түсуі;
қатты шайыр тірегі мен тұндырылған пептидті сүзу арқылы бөлу, және
пептидті бөліп алу үшін қышқыл ерітіндісімен пептидті экстракциялау.
Осы өнертабысқа сәйкес әдіс артықшылық береді, мұнда бірінші амин қышқылы Boc-L-Thr.
Осы өнертабысқа сәйкес әдіс артықшылық береді, мұнда бірінші амин қышқылы Boc-L-Thr цезий тұзы болып табылады, бірінші біріктіру өнімі ретінде Boc-L-Thr шайырын береді және блоктан шығарылған бірінші біріктіру өнімі H-L-Thr шайыры болып табылады. .
Осы өнертабыстың процесі артықшылықты болып табылады, онда Boc қорғаныс тобын жою үшін қолданылатын қышқыл үш фторсірке қышқылы (TFA) болып табылады.
Тікелей алдыңғы процеске қатысты қолайлы әдіс органикалық еріткіш метиленхлорид, хлороформ немесе диметилформамид және пептидті өсіретін реагент диизопропилкарбодимид, дициклогексилкарбодимид немесе N-этил-N"-(3-диметилопил-карбодидид) болып табылады. .
Тікелей алдыңғы әдіске қатысты артықшылықты әдіс келесі аминқышқылдары H-L-Thr-шайыр формуласының блоктандырылған бірінші қосылыс өнімі пайда болғаннан кейін (e) және (g) қадамдарын алты рет орындауды қамтитын әдіс болып табылады. ретімен тіркелген: Fmoc-L-Cys( Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) және Fmoc-L- Cys(Acm) H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-шайырды түзеді.
Тікелей алдыңғы әдіске қатысты таңдаулы әдіс H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-ға Boc-D--Nal қосуды қамтитын әдіс болып табылады. Boc-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Ast) алу үшін (c) қадамына сәйкес Cys(Acm) -Tnr-шайыр - Тр-шайыр.
Тікелей алдыңғы әдіске қатысты таңдаулы әдіс D--Nal қорғайтын Boc тобын, Тирді қорғайтын O-t-Bu тобын және Boc-D--Nal-Cys(Acm) ішіндегі Lys қорғайтын Boc тобын бір уақытта алып тастауды қамтиды. )-Tyr( O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-шайыр (i) қадамына сәйкес, H-D- формуласының шайырында аяқталған пептидті өнім алу үшін - Nal-Cys(Acm)-Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-шайыр.
Тікелей алдыңғы әдіске қатысты таңдаулы әдіс қатты шайырдан H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr пептидінің бөлінуін қамтиды: H-D-βNal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-шайырды құрамында спирті бар еріткіштегі аммиакпен және міндетті түрде апротикалық полярлы еріткішпен айтарлықтай толық жою үшін H-D алу үшін реакция --Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 .
Тікелей алдыңғы процеске қатысты таңдаулы процесс спирт метанол және полярлы апротикалық еріткіш диметилформамид болып табылады.
Тікелей алдыңғы әдіске қатысты қолайлы әдіс H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D формуласының аяқталған пептидті өніміндегі Cys қорғайтын Acm топтарын бір мезгілде жоюды және нәтижесінде қорғалмаған Cys қалдықтарын циклизациялауды қамтиды. -Trp-Lys-Val -Cys(Acm)-Thr-NH 2 H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH реакциясын жүргізу арқылы 2 спирттегі йод ерітіндісімен толық дерлік қорғаныссыздандыру және циклизациялау H-D--Nal--Thr-NH 2 береді.
Тікелей алдыңғы әдіске қатысты қолайлы әдіс пептид H-D--Nal--Thr-NH2 болатын әдіс болып табылады.
Тікелей алдыңғы әдіске қатысты қолайлы әдіс пептид соматостатиннің аналогы болып табылатын әдіс болып табылады.
Осы өнертабыстың сипаттамасында қолданылатын терминдер келесідей анықталады:
«бірінші амин қышқылы»: негізгі тізбектегі (бүйірлік тізбекте емес) амин тобы коммерциялық өнім болып табылатын немесе қарапайым дағдысы бар адамға белгілі әдістерге сәйкес синтезделетін Boc арқылы қорғалған кез келген амин қышқылын қамтиды. өнерде, мысалы, Boc-L-Thr;
"алғашқы тіркеме өнім": қатты тасымалдаушы шайырға бірінші амин қышқылын қосу нәтижесінде пайда болатын қатты тасымалдаушы шайырға бекітілген өнімді сипаттайды, мысалы, Boc-L-Thr шайыры;
"блокталған бірінші ілінісу өнімі": бірінші ілінісу өнімінен Boc тобын алу немесе алып тастау нәтижесінде пайда болатын өнімді сипаттайды - мысалы, H-L-Thr-шайыр, мұндағы "H" негізгі амин тобының қолжетімді сутегісі. қорғауды жою қадамынан туындайтын тізбек;
"келесі амин қышқылы": негізгі тізбектегі амин тобы Boc немесе Fmoc арқылы қорғалған кез келген амин қышқылын сипаттайды, ол коммерциялық қол жетімді немесе осы салада қарапайым дағдылардың біріне белгілі әдістерге сәйкес синтезделуі мүмкін. (c) қадамы және (e) қадамы бір реттен көп орындалатын қайталанатын циклге қосылуы мүмкін болғандықтан, (c) немесе (e) қадамы орындалған сайын, "келесі амин қышқылы" келесіден тәуелсіз таңдалуы мүмкін. негізгі тізбектегі амин тобы Boc немесе Fmoc арқылы қорғалған белгілі немесе синтезделетін амин қышқылдары тобы;
"(X+1)-ші келесі қосылудың бұғатталған өнімі": келесі амин қышқылының "келесі қосылудың бұғатталған өнімімен" қосылуының нәтижесі болып табылатын қатты тірек шайырына бекітілген өнімді сипаттайды. (c) және (d) қадамдары және (e) және (g) қадамдары келесі аминқышқылдары қосылатын қайталанатын циклге қосылуы мүмкін болғандықтан, "келесі тіркеменің (X+1) блокталған өнімі" термині қосылудың алдыңғы циклдарының әрқайсысының нәтижесінде алынған өнімді білдіреді;
"(X+1)-ші келесі қосылудың бұғатталған өнімі": "келесі (X+1)-ші қосылудың бұғатталған өнімінен" Fmoc тобын алып тастау нәтижесінде туындайтын өнімді сипаттайды;
"шайырдағы аяқталған пептидті өнім": пептидтік тізбекке N-терминалды амин қышқылы қосылғаннан кейін және N-терминалды аминқышқыл магистралінің амин тобы қорғанышсыздандырылғаннан немесе блокталғаннан кейін қатты тірек шайырына қосылған пептидті өнімді сипаттайды. , бірақ бүйірлік тізбектердің функционалдық топтарында әлі де кез келген қорғаныш топтары бар, N-терминалды амин қышқылының негізгі тізбегінен қорғаныс тобын жоюды жүзеге асыратын реакциямен жойылмаған; Және
"қорғалмаған шайырдағы аяқталған пептидті өнім": қатты шайыр тірегіне бекітілген пептидті өнімді сипаттайды, мұнда барлық қорғаныш топтары аминқышқылдарының бүйірлік тізбектерінің функционалдық топтарынан жойылған немесе қорғанысы жойылған.
Boc қорғанысын жою үшін пайдалануға болатын қышқылдардың мысалдары трифторсірке қышқылы (TFA), метансульфон қышқылы және құрамында HCl бар органикалық ерітінділер.
Fmoc қорғанысын жою үшін пайдаланылуы мүмкін бастапқы және қайталама аминдердің мысалдары 4-(аминометил)пиперидин, пиперидин, диэтиламин, DBU және трис(2-аминоэтил)амин.
Босатылған амин топтарының TFA тұздарын бейтараптандыру үшін қолдануға болатын нуклеофильді емес негіздердің мысалдары (RNH 3 + CF 3 COO - бұл тұздар келесі амин қышқылын қосқанға дейін немесе қосу кезінде «бос» аминдерге (NH 2) айналуы керек , әйтпесе қосу орын алмайды) диизопропилетиламин (DIEA) және триэтиламин (TEA) болып табылады.
Амин қышқылын қосу реакцияларында қолдануға болатын органикалық еріткіштердің мысалдары: метиленхлорид, хлороформ, дихлорэтан, диметилформамид, диэтилацетамид, тетрагидрофуран, этилацетат, 1-метил-2-пирролидон, ацетонитрил немесе осы еріткіштердің комбинациясы.
Пептидті ұзартқыштардың мысалдарына ауыстырылған карбодиимидтер жатады, мысалы: диизопропилкарбодимид, дициклогексилкарбодимид немесе N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимид.
Пептидтік амидтік байланыстың түзілуіне қатысатын карбоксил топтары мен амин топтары сәйкесінше «бүйірлік тізбек» карбоксил тобы немесе амин тобы деп аталады. Екінші жағынан, пептидтік амидтік байланыстың түзілуіне қатыспайтын кез келген аминқышқылдарының функционалдық топтары «бүйірлік тізбек» функционалды топтары деп аталады.
«Негізге төзімді топ» термині (1) негізге төзімді, мысалы, 4-(аминоэтил)пиперидин, пиперидин немесе трис(2) сияқты негіздер арқылы жойылмайтын аминқышқылдарының функционалдық топтарын қорғау үшін қолданылатын қорғау топтарын білдіреді. -аминоэтил)амин, әдетте Fmoc қорғау тобын жою үшін пайдаланылатын негіздер болып табылады және (2) трифторсірке қышқылы сияқты қышқылмен немесе каталитикалық гидрлеу сияқты басқа әдіспен жойылуы мүмкін.
"Fmoc" және "Boc" таңбалары осы жерде және ілеспе формулада сәйкесінше 9-фторенилметоксикарбонил мен t-бутилоксикарбонилді белгілеу үшін қолданылады.
Жоғарыда сипатталған әдіс пептидтерді, жақсырақ соматостатин аналогтарын дайындау үшін пайдаланылуы мүмкін, мысалы, келесі формуласы бар Lanreotide® октапептиді: H-D--Nal--Thr-NH 2 . Егер H-D--Nal--Thr-NH 2 синтезделетін болса, Cys, Lys және Tyr бүйірлік тізбегінің функционалды топтарын қорғау үшін қолданылатын негізге төзімді қорғаныс топтары сәйкесінше ацетамидометил (Acm), Boc және терт-бутил болуы мүмкін. Asm Cys-тен артық.
Соматостатиннің аналогы деп соматостатинге ұқсас (яғни, агонист) немесе оған қарама-қарсы (яғни, антагонист) биологиялық белсенділікті көрсететін пептид түсініледі.
H-D--Nal--Thr-NH 2 формуласында әдеттегі үш әріпті амин қышқылы таңбаларының әрқайсысы (мысалы, Lys) құрылымдық аминқышқылының қалдығын білдіреді. Мысалы, жоғарыдағы формуладағы Lys таңбасы -NH-CH((CH 2) 4 NH 2)-CO- білдіреді. D- -Nal- таңбасы D-2-нафтилаланилил амин қышқылының қалдығын білдіреді. Жақшалар пептидтегі екі Cys қалдығының бос тиолдарын байланыстыратын дисульфидті байланысты білдіреді, бұл жақша ішіндегі пептидтің аминқышқылдары цикл құрайтынын көрсетеді.
Осы жерде берілген сипаттамаға сүйене отырып, осы өнер саласында білікті адам осы өнертабысты барынша толық пайдалана алады.
Егер басқаша анықталмаса, осы құжатта қолданылатын барлық техникалық және ғылыми терминдер осы өнертабысқа жататын өнерде қарапайым дағдылары бар адамдар түсінетіндей мағынаға ие болады. Сонымен қатар, осы құжатта келтірілген барлық жарияланымдар, патенттік өтінімдер, патенттер және басқа сілтемелер оларға сілтеме жасау арқылы енгізілген.
Пептидті осы өнертабыстың әдісіне сәйкес келесі процедура бойынша дайындауға болады.
Цезий карбонатының 0,5 молярлық эквивалентінің судағы ерітіндісі Boc-AA 1 (Бахем Калифорния, Торранс, CA) 1 молярлық эквивалентінің ерітіндісіне баяу қосылады, мұнда AA 1 спиртте ерітілген С-терминал амин қышқылына сәйкес келеді, жақсырақ. метанол. Алынған қоспаны бөлме температурасында шамамен 1 сағат бойы араластырды, содан кейін барлық алкоголь мен барлық суды төмендетілген қысыммен алып тастап, Boc-AA 1 цезий тұзының құрғақ ұнтағын берді. Мерифилд шайыры, 1,0 эквиваленттері (хлорметилденген полистирол, 200-400 тор, хлорид ионының қосылуы 1,3 мекв/г, Advanced ChemTech, Луисвилл, Кентукки немесе Полимер зертханалары, Черч Стреттон, Англия) жақсырақ хлор-метилденген полистиролмен жуылады (DCM, хлор-метилді ерітіндімен). ), алкоголь, жақсырақ метанол және полярлы апротикалық еріткіш, жақсырақ диметилформамид (DMF). Цезий тұзы Boc-AA 1 ұнтағы сусыз (құрғақ) полярлы апротикалық еріткіште, жақсырақ DMF-де ерітіледі және ерітінді бұрын жуылған шайырмен біріктіріледі. Шламды азот сияқты инертті атмосферада шамамен 45°-65°C, жақсырақ 50°-60°C, шамамен 48-106 сағат, жақсырақ 85-90 сағат бойы ақырын араластырады. Шайыр сүзу арқылы бөлінеді және полярлы апротикалық еріткішпен, жақсырақ DMF, сумен және ең соңында MeOH сияқты спиртпен мұқият жуылады. Boc-AA 1 шайыры төмендетілген қысыммен кептіріледі.
Boc-AA 1 -шайыр дөрекі балқытылған шыныдан жасалған сүзгі түбі бар шыны реакторға енгізіледі. Шайыр DCM сияқты хлорланған еріткішпен жуылады, органикалық қышқылмен блокталады, жақсырақ DCM-де 25% TFA, DCM сияқты хлорланған ерітіндімен және MeOH сияқты спиртпен қысқаша жуылады, органикалық негізмен, жақсырақ триэтиламинмен бейтараптандырылады. DCM және DCM және DMF сияқты полярлы апротикалық еріткішпен қайтадан жуылады және қорғалмаған AA 1 шайырын береді.
Амин қышқылдарының кез келген қажетті саны одан кейін қорғалмаған AA 1 шайырына қосымша бекітіледі. Келесі амин қышқылында Fmoc қорғанысы бар α-амин тобы болса (Fmoc-AA x), онда бүйірлік тізбек тобы не қорғауды қажет етпейді (мысалы, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe немесе Fmoc- Thr) немесе бүйірлік тізбекті негізге төзімді топпен қорғаңыз. Fmoc-AA x молярлық артық мөлшері (мұндағы x - пептидтегі амин қышқылының позициясының нөмірі, C-соңғысынан есептеледі) қорғалмаған AA 1 шайырына диизопропилкарбодимид сияқты пептидті өсіретін реагентпен шамамен 60 минут бойы бекітіледі. (DIC), DCM/DMF қоспасында. Қосылған шайыр Fmoc-AA x -AA 1 шайырын алу үшін DMF, спирт және DCM-мен жуылды. Тіркеуді Кайзер нинидрин әдісімен тексеруге болады. Содан кейін, Fmoc-AA x -AA 1 шайыры DMF-пен бір рет жуылады, содан кейін AA x -AA 1 шайырын алу үшін DMF құрамындағы пиперидин сияқты органикалық еріткіштегі негіз ерітіндісімен блокталады. Содан кейін AA x -AA 1 шайыры DMF, содан кейін MeOH және DCM сияқты спиртпен бірнеше рет жуылады. Содан кейін AA x -AA 1 шайыры шамамен 3 минут бойы DMF-пен, үш рет изопропанолмен, жақсырақ әр жолы шамамен 2 минуттан және DCM-мен үш рет, жақсырақ әр жолы 2 минуттай жуылады. Содан кейін шайыр жоғарыда сипатталғандай Fmoc қорғалған амин қышқылын немесе төменде сипатталғандай Boc қорғалған амин қышқылын одан әрі бекітуге дайын болады.
Сол сияқты, егер қорғалмаған AA 1 шайырына жалғанатын кез келген келесі амин қышқылы қорғалған Boc-amino тобымен (Boc-AA x) таңдалса, бүйірлік тізбек тобы үшін қорғаныс қажет емес (бұл Boc-Gly болуы мүмкін). , Boc-Ala, Boc-Phe немесе Boc-Thr) немесе бүйірлік тізбек Boc-Cys(Acm) болуы мүмкін қышқылмен де, негізмен де жойылуға төзімді топпен қорғалуы керек. Егер Boc-AA x таңдалса, ол Fmoc-амин қышқылдары үшін жоғарыда сипатталғандай бірдей реагенттер мен еріткіштер арқылы бекітіледі және бекітудің толықтығын (аяқталуын) Кайзер нинидрин әдісімен тексеруге болады. Содан кейін, Boc-AA x -AA 1 шайыры CF 3 CO - H + -AA x -AA 1 шайырын беру үшін DCM-дегі TFA сияқты органикалық еріткіштегі қышқыл ерітіндісімен қорғанысын алып тастайды. Содан кейін бұл шайыр DCM сияқты хлорланған еріткішпен, MeOH сияқты спиртпен бірнеше рет жуылады және DCM құрамындағы триэтиламин сияқты нуклеофильді емес негізмен бейтараптандырылады, содан кейін DCM сияқты хлорланған еріткішпен тағы бірнеше рет жуылады. AA x -AA 1 - шайыр. Содан кейін шайыр жоғарыда сипатталғандай қорғалған Boc немесе Fmoc амин қышқылын одан әрі бекітуге дайын болады.
Пептидтің қалаған тізбегіне және пайдаланылатын α-аминоқорғалған амин қышқылының түріне (Fmoc қорғалған немесе Boc қорғалған) байланысты жоғарыда көрсетілген бекіту процедураларының сәйкес комбинациясы қолданылады. пептидтер тізбегі - бүйірлік тізбек , не Fmoc-ты α-амин тобынан шығару үшін қажетті негізмен немесе α-амин тобынан Boc шығаруға қажетті қышқылмен жойылуы мүмкін қорғаныс тобы бар. Мұндай қорғалған амин қышқылы N-β-Boc-N″-β-Fmoc-лизин немесе N-β-Fmoc-N″-β-Бок-лизин болуы мүмкін. Олай болса, N-терминалды амин қышқылына дейінгі келесі аминқышқылдарының α-амин топтары үшін барлық таңдалатын қорғаныш топтары осы позиция үшін таңдалған бүйірлік топтық қорғаныспен үйлесімді болуы керек. Бұл бүйірлік тізбекті қорғайтын топтар келесі аминқышқылдарының α-амин топтарын қорғауды жою үшін қолданылатын блоктаушы агентке төзімді болуы керек дегенді білдіреді. N-терминалды амин қышқылы үшін Boc немесе Fmoc не α-аминоқорғаныс ретінде пайдаланылуы мүмкін, өйткені N-терминалды амин қышқылының қорғанысын жою кейбір қорғалған бүйірлік тізбектерді пептидтердің синтезінің стратегиясына жағымсыз әсер етпей-ақ бір мезгілде қорғауды жоюы мүмкін, өйткені жоқ. аминқышқылдары енді қол жетімді.
Шайырға әлі де бекітілген аяқталған пептидтік тізбекті қорғауды алып тастау және босату керек. Барлық негізге төзімді қорғаныс топтарын және N-терминалды амин қышқылының α-аминоблокатор тобын жою үшін, егер қолданылса, шайырдағы пептид DCM ішіндегі TFA сияқты органикалық еріткіштегі қышқылмен өңделеді. Кез келген қышқылға төзімді қорғаныс топтарын және N-терминалды амин қышқылының α-аминоблокатор тобын жою үшін, егер қолданылса, шайырдағы пептид DMF құрамындағы пиперидин сияқты органикалық негізмен өңделеді. Балама түрде, қышқылға төзімді топтар пептидті аммиакпен немесе амин негізімен кейінгі ыдырату кезінде жойылғанға дейін сақталуы мүмкін. Содан кейін қорғалмаған шайырдағы пептид DCM сияқты хлорланған еріткішпен, MeOH сияқты спиртпен жуылады және төмендетілген қысыммен тұрақты салмаққа дейін кептіріледі.
Пептид шайырдан бөлінеді және пептидті шайырға 3:1 MeOH/DMF мөлшерінде суспензиялау арқылы С-терминусы амидке айналады. Шламды азот атмосферасында шамамен 10°С-тан төмен температураға дейін салқындатады, ал сусыз аммиак еріткіш бетінің астына ерітінді онымен қаныққанға дейін енгізіледі, ал температура шамамен 10°С-тан төмен сақталады. Шламды шамамен 24 сағат бойы ақырын араластырып, температураның шамамен 20°C дейін көтерілуіне мүмкіндік береді. Реакцияның аяқталу дәрежесі пептид түріне байланысты қолайлы жағдайларда HPLC-де метил эфирінің аралық өнімінің жоғалуымен тексеріледі. реакция қоспасысалқындатыңыз және метил эфиріне сәйкес келетін HPLC шыңының ауданы мақсатты өнімнің ең жоғары ауданының 10% аз болғанша сусыз аммиактың қажетті мөлшерін қосыңыз. Шламды шамамен 10°C төменге дейін салқындатады және пептидті тұндыру үшін түні бойы араластыруды жалғастырады. Тұнба мен шайыр сүзу арқылы бөлініп, салқын MeOH-мен жуылады. Тұнба мен шайыр төмендетілген қысыммен кептіріледі, өнімді шайырдан сірке қышқылының сулы ерітіндісімен бөліп алады.
Егер пептид өз ретімен қорғалған Cys қалдықтарын қамтыса, тиол топтарын қорғауды алып тастауға және қалдықтарды келесі процедураға сәйкес циклизациялауға болады. Cys қорғалған Asm топтары бар пептид азот атмосферасында сірке қышқылының сулы ерітіндісінде ерітіледі. Ерітіндіні тез араластырады және бір бөлікке йодтың спирттегі ерітіндісін қосады. Қоспа араластырылады және қорғаныштың толық жойылуы үшін HPLC арқылы тексеріледі. Содан кейін 2% натрий тиосульфаты ерітіндісімен ерітіндінің түсі жоғалғанша титрлеу арқылы реакция тоқтатылады. Шикі қоспа 0,1 аммоний ацетаты буферіндегі ацетонитрил градиенті бар C8 картриджінде препаративті хроматография арқылы тазартылды, 0,25 Н сірке қышқылында ацетонитрил градиенті бар C8 картриджінде тұзсыздандырылды және мақсатты пептидті алу үшін лиофилизацияланды.
Өнертабыстың үлгілі нұсқасы
Төмендегі мысал осы өнертабыстың әдісін көрсету үшін берілген және оның қолданылу аясын шектейтіндей түсіндірілмеуі керек.
Мысал 1. H 2 -D- -Nal--Thr-NH 2
A) Boc-L-Thr-шайыр
2,5 мл судағы 2,58 г цезий карбонатының ерітіндісі 7 мл метанолда ерітілген 3,48 г Boc-L-треонин (Bachem California, Torrance, CA) ерітіндісіне баяу қосылды. Алынған қоспаны бөлме температурасында шамамен 1 сағат бойы араластырды, содан кейін барлық метанол және барлық су төмендетілген қысыммен жойылып, Boc-L-треонин цезий тұзының құрғақ ұнтағын берді. 10 г Мэрифилд шайыры (хлорметилденген полистирол, 200-400 тор, хлор қосындысы 1,3 мекв/г, Advanced ChemTech, Луисвилл, Кентукки) дихлорометанмен (DCM), метанолмен (MeOH) және диметилформамидпен (DM2 рет) жуылды. мл). Boc-L-треониннің цезий тұзының ұнтағы 60 мл құрғақ DMF-де ерітілді және ерітінді жоғарыда көрсетілгендей жуылған шайырмен біріктірілді. Қоспа шамамен 50°-60°C температурада азот астында шамамен 85-90 сағат бойы ақырын араластырылды. Шайыр сүзу арқылы бөлініп, DMF, ионсыздандырылған сумен және ең соңында MeOH-пен мұқият жуылды. Бок-треонин шайыры төмендетілген қысымда шамамен 40°C температурада кептірілді. Треониннің қосылуы 0,85±0,15 мекв/г құрғақ шайырды құрады.
B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-шайыр
(А) қадамындағы 2,0 г Бок-треонин шайыры түбі дөрекі балқытылған шыны сүзгі (жүктеме 1,74 ммоль) бар 50 мл шыны реакторға енгізілді. Шайыр 2 рет DCM (20 мл), әр жолы шамамен 5 минут бойы жуылды, DCM (30 мл) ішіндегі 25% TFA арқылы блокталады - бірінші рет шамамен 2 минут және екінші рет шамамен 25 минут, жуылды 3 рет шамамен 2 мин DCM (20 мл), изопропанол (20 мл) және DCM (20 мл), шамамен 5 минут бойы екі рет бейтараптандырылған DCM (20 мл) ішіндегі 10% триэтиламинмен, шамамен 2 мин 3 рет жуылады. DCM-мен және бір рет DMF (20 мл) шамамен 5 минут бойы жуылады.
Блокталған шайырға 1,8 г (4,35 ммоль, 2,5 экв.) Fmoc-L-цистеин (Acm) (Bachem, CA) және 683 мкл (4,35 ммоль, 2,5 экв.) диизопропил-карбодиимид (DIC) 14 жылы қосылды. мл 2:1 DCM/DMF шамамен 1 сағат 2 мин DXM (20 мл). Байланыстыру Кайзер нигидрин әдісімен тексерілді.
Бекітілгеннен кейін шайыр 1 рет DMF-пен жуылды, содан кейін DMF-тегі пиперидин ерітіндісімен блокталады. Блокталған шайыр содан кейін DMF-мен жуылды және MeOH және DCM-мен бір уақытта бірнеше рет жуылды. Ілініс шайыры 1 рет шамамен 3 минут бойы DMF (20 мл), 3 рет шамамен 2 минут изопропанолмен (20 мл) және 3 рет DCM (20 мл) әр жолы шамамен 2 минут бойы жуылды. Байланыстыру Кайзер нингидрин әдісімен тексерілді.
Келесі қорғалған амин қышқылдарының әрқайсысы DMF/DCM ішіндегі DIC көмегімен жуылған шайырға қосылды және жоғарыда сипатталғандай келесі ретпен шығарылды: Fmoc-L-валин, Fmoc-L-лизин(Boc), Fmoc-D-триптофан, Fmoc-L-тирозин (O-t-Bu) және Fmoc-L-цистеин (Acm) (барлығы Бахем Калифорниядан), Boc-D-2-нафтилаланин (Synthech, Olbany, OR).
Аяқталған пептидтік тізбек блоктан шығарылды және екі рет 75:20:5 DCM/TFA/анизолмен (30 мл) шамамен 2 минут және шамамен 25 минут бойы қорғалды, әр жолы шамамен 2 минут бойы DCM (20 мл), изопропанолмен 3 рет жуылды. (10 мл) және DCM (20 мл), DCM (20 мл) ішіндегі 10% триэтиламинмен 2 рет шамамен 5 минут бойы бейтараптандырылды және шамамен 2 минут бойы DCM (20 мл) және MeOH (20 мл) 3 рет жуылады. Шайыр төмендетілген қысыммен кептірілді. Құрғақ салмағы 3,91 г (теориялық шығымның 103%) құрады.
B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2
(B) қадамындағы 2,93 г пептидпен жүктелген шайыр (1,3 ммоль-экв.) 50 мл 3:1 MeOH/DMF қоспасында суспензияланды. Шламды азот атмосферасында шамамен 10°С-тан төмен температураға дейін салқындатып, ерітінді онымен қаныққанша құрғақ аммиак газын тазартты, ал температура шамамен 10°С-тан төмен сақталды. Шламды шамамен 24 сағат бойы ақырын араластырып, температураның шамамен 20°C дейін көтерілуіне мүмкіндік берді. Реакцияның аяқталу дәрежесі HPLC (VYDAC® сорбенті, түйіршік өлшемі 5 мкм, кеуек өлшемі 100 Å, C18, изократиялық жағдайда элюция 26% CH 3 CN 0,1% TFA, жылдамдығы 1 мл/мин, 220 мм-де жазу; осы жағдайларда метил эфирі үшін баяулау уақыты Rt ~ 14 мин және амид өнімі үшін ~ 9,3 мин). Реакция қоспасы салқындатылды және сусыз аммиактың артық мөлшері HPLC-де метил эфиріне сәйкес келетін шыңның ауданы қажетті өнімнің ең жоғары аймағының 10% -нан аз болғанша қосылды. Қоспа шамамен 10°C төмен температураға дейін салқындатылды, пептидті тұндыру үшін түні бойы араластыру жалғасты. Тұнба мен шайыр сүзу арқылы бөлініп, 15 мл суық MeOH-мен жуылды. Тұнба мен шайыр төмендетілген қысыммен кептірілді, өнім шайырдан 50% сулы сірке қышқылы ерітіндісімен (3 х 30 мл) экстракцияланды. HPLC талдауы қоспадағы 870 мг (0,70 ммоль) атаулы өнімді көрсетті (изократиялық HPLC жүйесінде 96% таза).
D) H-D- -Nal--Thr-NH 2
(В) қадамындағы 500 мг (0,40 ммоль) пептид 300 мл 4% сірке қышқылында ерітілді және азот астында шамамен 55 ° C дейін қыздырылды. Ерітіндіні тез араластырып, бір бөлікке 7,7 мл MeOH (0,60 ммоль) құрамындағы 2% с/т йод ерітіндісі қосылды. Қоспа шамамен 15 минут бойы араластырылды, содан кейін реакция түс жоғалғанша (~2 мл) 2% натрий тиосульфаты ерітіндісімен титрлеу арқылы тоқтатылды. Қоспа дейін салқындатылды бөлме температурасыжәне сүзгіден өткен. Қоспа 0,1 М аммоний ацетатындағы ацетонитрил градиенті бар C8 колоннасында (YMC, Inc., Wilmington, NC) препаративті хроматография арқылы тазартылды, 0,25 Н сірке қышқылында ацетонитрил градиенті бар C8 YMC колоннасында тұзсыздандырылды және 99% тазалықта 350 мг мақсатты пептидті алу үшін лиофилденген.
Жоғарыда келтірілген сипаттамаға сүйене отырып, техникада білікті адам осы өнертабыстың маңызды белгілерін оңай тани алады және оның рухы мен ауқымынан шықпай, оны әртүрлі қолданбалар мен жағдайларға бейімдеу үшін өнертабысқа әртүрлі өзгерістер мен түрлендірулер енгізе алады. Осылайша, өнертабыстың басқа нұсқалары да өнертабыстарға жатады.
ТАЛАП
1. H-D--Nal--Thr-NH2 формуласының пептидін дайындау әдісі, аталған әдіс келесі қадамдарды қамтиды:
(а) бірінші амин қышқылын қатты тіреуіш шайырға эфирлік байланыс арқылы "бірінші қосылатын өнім" түзу үшін қосу, оған мыналар кіреді: (i) цезий карбонатының судағы ерітіндісін бірінші амин қышқылының спирттік ерітіндісімен әрекеттесу. бірінші амин қышқылының цезий тұзы, (іі) бірінші амин қышқылының еріткішсіз цезий тұзын алу, (ііі) қатты тірек шайырын сусыз полярлы апротикалық еріткіште бірінші амин қышқылының цезий тұзымен әрекеттесу. «бірінші қосылған өнім»,
мұндағы бірінші амин қышқылы осы пептидтің С-соңғы амин қышқылына сәйкес келетін Boc-L-Thr, ал қатты ортадағы шайыр хлорметилденген полистирол шайыры болып табылады;
(b) "қорғаусыз бірінші қосу өнімін" қалыптастыру үшін қышқылмен бірінші қосылған өнімнен Boc қорғанысын жою;
(c) Таңдау бойынша, "блокталған бірінші тіркеме өнімге" "келесі амин қышқылын" қосу, оған "келесі амин қышқылын" пептидті өсіретін реагентті алу үшін органикалық еріткіштегі "блокталған бірінші тіркеме өніммен" әрекеттесу кіреді. «Келесі аминқышқылдарының» негізгі тізбегінде Boc-блокталған амин тобы бар және егер бұл «келесі амин қышқылының» бүйірлік тізбегінде бір немесе бірнеше функционалдық топтары болса, онда «келесі амин қышқылының» негізгі тізбегі бар. бүйірлік тізбектегі функционалдық топтар қорғауды қажет етпейді немесе бүйірлік тізбектегі осы функционалдық топтарда тиісінше Boc және Fmoc қышқылды немесе сілтілі қорғанысты жою агенттеріне тұрақты қорғаныш топтары бар;
(d) "блокталған келесі өнімді" алу үшін "блокталған келесі өнімді" қышқылмен әрекеттесуді қамтитын Boc-ті "блокталған келесі өнімнен" қорғауды жою;
(e) таңдау бойынша, (c) және (d) қадамдары қайталанады, әрбір цикл "келесі (X+1)-ші тіркеменің бұғатталған өнімін" шығарады, мұнда X - қайталану қажет циклдар саны;
(e) "келесі амин қышқылын" (b) қадамындағы "блокталған бірінші буын өніміне" немесе (е) қадамындағы "келесі (X+1)-ші буынның бұғатталған өніміне" міндетті түрде қосу. пептидті өсіруге арналған реагенті бар органикалық еріткіште көрсетілген «бірінші тіркеменің блоктандырылған өнімімен» немесе көрсетілген «келесі тіркеменің бұғатталған өнімімен» «келесі амин қышқылы» реакциясын жүргізуді қамтиды. "Келесі амин қышқылының блокталған келесі тіркеме өнімін" алу үшін және бұл "келесі амин қышқылында" Fmoc блокталған негізгі тізбек амин тобы бар, егер сол "келесі амин қышқылында" бүйірлік тізбекте бір немесе бірнеше функционалды топтар болса, онда функционалдық топтар бүйірлік тізбекте қорғанысты қажет етпейді немесе бүйірлік тізбектегі функционалдық топтарда Fmoc қорғанысын жою үшін қолданылатын сілтілі реагенттерге төзімді қорғаныс топтары бар;
(g) "блокталған келесі өнімді" алу үшін "блокталған келесі өнімді" негізгі немесе қайталама аминмен әрекеттесуді қамтитын "блокталған келесі өнімді" Fmoc қорғанысын жою;
(h) таңдау бойынша, (e) және (g) қадамдарын қайталау, әрбір цикл "келесі (X+1)-ші тіркеменің бұғатталған өнімін" шығарады, мұнда X - цикл қайталануларының қажетті тізімге енгізілгенге дейінгі саны. пептид және соңғыдан кейінгі амин қышқылы шығарылады;
(i) N-терминал амин қышқылын келесі (X+1)-ші қосылыстың блоктандырылған өнімімен әрекеттесуді қамтитын N-терминал амин қышқылын қосу. "N-терминалды амин қышқылында" Boc немесе Fmoc арқылы блокталған негізгі амин тобы бар "блокталған толық тіркеме өнімін" қалыптастыру үшін пептидті ұзартуға арналған реагент бар органикалық еріткіштегі қосылу";
(j) шайырда аяқталған пептидті өнімді қалыптастыру үшін Boc жағдайында қышқылмен немесе Fmoc жағдайында негізбен әрекеттесуді қамтитын "блокталған аяқталған өнімнен" Boc немесе Fmoc қорғанысын жою;
(j) егер "шайырмен аяқталатын пептидті өнімде" бүйірлік тізбектің функционалдық топтары болса, онда "шайырмен аяқталатын пептидті өнім" бүйірлік тізбектің функционалдық топтарын қорғауды жою, оған "шайырмен аяқталатын пептидті өнім" тиісті қорғаныс реагенттерімен әрекеттесу кіреді. «қорғаусыз шайырдағы толық пептидті өнімді» өндіру; Және
(k) пептидті "шайырдағы дайын пептидті өнім" немесе "қорғаусыз шайырдағы дайын пептид өнімі" қатты шайыр тасымалдаушысынан бөлу, ол реакцияға түсетін "шайырдағы дайын пептидті өнім" немесе "шайырдағы дайын пептид өнімі" кіретін пептидті алу; шайырдан пептидтің ыдырауы аяқталғанша аммиакпен, біріншілік аминмен немесе қайталама аминмен шайыр"; қорғалмаған шайыр";
пептид синтезіндегі (e) және (g) қадамдары келесі аминқышқылдары қосылатын H-L-Thr-шайыр формуласының "блокталған бірінші қосылыс өнімі" түзілгеннен кейін алты рет жүзеге асырылуы шартымен ретімен: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc -L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) және Fmoc-L-Cys (Acm) H-Cys(Acm)-Tyr (O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-шайыр түзеді.
2. 1-тармаққа сәйкес әдіс, мұнда (k) қадамдағы аммиак, біріншілік амин немесе қайталама амин құрамында спирті бар еріткіште және міндетті түрде апротикалық полярлы еріткіш болады.
3. 1-тармаққа сәйкес әдіс, мұнда (l) қадам келесі қадамдарды қамтиды:
(і) еріткіштен бөлінген пептидті тұндыру;
(ii) қатты шайыр тірегі мен тұндырылған пептидті сүзу және
(iii) пептидті бөліп алу үшін қышқыл ерітіндісімен пептидті экстракциялау.
4. 1-3 тармақтардың кез келген біріне сәйкес әдіс, мұнда бірінші амин қышқылы Boc-L-Thr цезий тұзы болып табылады, бірінші ілінісу өнімі ретінде Boc-L-Thr шайырын береді және "блокировкаланған бірінші қосылыс өнімі" " H-L-Thr -шайыр болып табылады.
5. 4-тармаққа сәйкес әдіс, мұнда (i) қадамда Boc қорғаныс тобын жою үшін қолданылатын қышқыл үш фторсірке қышқылы (TFA) болып табылады.
6. Органикалық еріткіш метиленхлорид, хлороформ немесе диметилформамид, ал пептидті өсіретін реагент диизопропилкарбодимид, дициклогексилкарбодимид немесе N-этил-N"-(3-диметил-аминбодимид) болатын органикалық еріткіш болып табылатын 5-бапқа сәйкес әдіс.
7. 6-бапқа сәйкес әдіс, H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-шайырға Boc-D--Nal қосуды қамтиды. (i) қадамына сәйкес Boc-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-шайырды алу.
8. 7-бапқа сәйкес әдіс, оның ішінде D--Nal блоктаушы Boc тобын, Тирді қорғайтын O-t-Bu тобын және Boc-D- -Nal-Cys(Acm)- ішіндегі Lys қорғайтын Boc тобын бір мезгілде жою. Tyr(O-t -Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-шайыр, H-D--Nal-Cys формуласының шайырында аяқталған пептидті өнім алу үшін (d) қадамына сәйкес (Acm)-Tyr-D -Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-шайыр.
9. H-D- реакциясын жүргізу арқылы қатты шайырдан H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr пептидін бөлуді қамтитын 8-бапқа сәйкес әдіс. -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Тр-шайыры бар аммиак құрамында спирті бар еріткіште және міндетті түрде апротикалық полярлы еріткіште айтарлықтай толық жойылғанша H-D--Nal береді. -Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 .
10. Спирт метанол және полярлы апротикалық еріткіш диметилформамид болып табылатын 9-бапқа сәйкес процесс.
11. H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D формуласының "шайырдағы толық пептидті өнімде" Cys қорғайтын Acm топтарын бір мезгілде жоюды және нәтижесінде қорғалмаған Cys қалдықтарын циклизациялауды қамтитын 10-бапқа сәйкес әдіс. -Trp- Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH реакциясын жүргізу арқылы 2 спирттегі йод ерітіндісімен қорғанышсыздануды және циклизацияны айтарлықтай аяқтау үшін H-D--Nal--Thr-NH 2 береді.
