Tahkefaasi süntees. Peptiidide struktuur. Peptiidsideme moodustumise reaktsioonid

Kombinatoorset sünteesi saab läbi viia mitte ainult lahuses (vedelfaasiline süntees), vaid ka keemiliselt inertse tahke faasi pinnal. Sel juhul "õmmeldakse" esimene lähtematerjal keemiliselt polümeerkandja pinnal olevate funktsionaalrühmade külge (enamasti kasutatakse ester- või amiidsidet) ja töödeldakse teise lähteaine lahusega, mis võetakse märkimisväärne ülejääk, et reaktsioon kulgeks lõpuni. Selle reaktsioonivormi puhul on teatud mugavus, kuna hõlbustatakse toodete eraldamise tehnikat: polümeer (tavaliselt graanulite kujul) lihtsalt filtreeritakse välja, pestakse põhjalikult teise reagendi jääkidest ja sihtühend eemaldatakse. sellest keemiliselt eraldatud.

Orgaanilises keemias pole ühtegi reaktsiooni, mis praktikas annaks igal juhul sihtproduktide kvantitatiivse saagise. Ainus erand näib olevat orgaaniliste ainete täielik põlemine hapnikus kõrge temperatuur CO 2 ja H 2 O. Seetõttu on sihtsaaduse puhastamine alati hädavajalik ning sageli ka kõige raskem ja aeganõudvam ülesanne. Eriti keeruline ülesanne on peptiidide sünteesi produktide eraldamine, näiteks polüpeptiidide komplekssegu eraldamine. Seetõttu on peptiidide sünteesis enim kasutatud tahkel polümeersubstraadil sünteesimeetodit, mille töötas välja 1960. aastate alguses R. B. Merifield.

Merrifieldi meetodi polümeerkandjaks on granuleeritud ristseotud polüstüreen, mis sisaldab klorometüülrühmi benseenitsüklites, mis on linkerid, mis seovad kandja polüpeptiidi esimese aminohappejäägi külge. Need rühmad muudavad polümeeri bensüülkloriidi funktsionaalseks analoogiks ja annavad sellele võime kergesti moodustada estersidemeid reaktsioonil karboksülaadi anioonidega. Sellise vaigu kondenseerimine N-kaitstud aminohapetega viib vastavate bensüülestrite moodustumiseni. N-kaitse eemaldamine annab polümeeriga kovalentselt seotud esimese aminohappe C-kaitstud derivaadi. Vabanenud aminorühma aminoatsüülimine teise aminohappe N-kaitstud derivaadiga, millele järgneb N-kaitse eemaldamine, annab sarnase dipeptiidi derivaadi, mis on samuti seotud polümeeriga:

Sellist kaheastmelist tsüklit (deprotekteerimine – aminoatsüülimine) saab põhimõtteliselt korrata nii palju kordi, kui on vaja etteantud pikkusega polüpeptiidahela ehitamiseks.

Merifieldi ideede edasiarendamine oli suunatud eelkõige uue leidmisele ja loomisele polümeermaterjalid substraatide jaoks toodete eraldamise meetodite väljatöötamine ja automatiseeritud seadmete loomine kogu polüpeptiidide sünteesi tsükli jaoks

Merifieldi meetodi tõhusust on näidanud mitmete looduslike polüpeptiidide, eriti insuliini, edukas süntees. Eriti selgelt on selle eeliseid demonstreeritud ensüümi ribonukleaasi sünteesi näitel. Nii näiteks tegi Hirschman ja 22 töötajat mitme aasta jooksul märkimisväärsete jõupingutuste hinnaga ensüümi ribonukleaasi (124 aminohappejääki) sünteesi traditsiooniliste vedelfaasi meetodite abil. Peaaegu samaaegselt saadi sama valk automaatse tahke faasi sünteesiga. Teisel juhul süntees, mis sisaldab kokku 11 931 erinevat operatsiooni, sealhulgas 369 keemilised reaktsioonid, valmis kahe osaleja (Gatte ja Merrifield) poolt vaid mõne kuuga.

Loomise aluseks olid Merrifieldi ideed erinevaid meetodeid mitmesuguse struktuuriga polüpeptiidide raamatukogude kombinatoorne süntees.

Nii pakuti 1982. aastal välja algne strateegia peptiidide mitmeastmeliseks paralleelseks sünteesiks tahkel faasil, mida tuntakse "jagamismeetodina" ( poolitatud- poolitamine, eraldamine) või "segamise ja poolitamise" meetod (joonis 3). Selle olemus on järgmine. Oletame, et kolmest aminohappest (A, B ja C) on vaja saada kõikvõimalikud tripeptiidide kombinatsioonid. Selleks jagatakse tahke polümeerkandja (P) graanulid kolmeks võrdseks osaks ja töödeldakse ühe aminohappe lahusega. Sel juhul on kõik aminohapped keemiliselt seotud polümeeri pinnaga ühe nende funktsionaalrühma kaudu. Saadud kolme klassi polümeerid segatakse põhjalikult ja segu jagatakse uuesti kolmeks osaks. Seejärel töödeldakse iga osa, mis sisaldab kõiki kolme aminohapet võrdsetes kogustes, uuesti ühega samast kolmest aminohappest ja saadakse üheksa dipeptiidi (kolm kolme toote segu). Teine segamine, jagamine kolmeks võrdseks osaks ja töötlemine aminohapetega annab soovitud 27 tripeptiidi (kolm üheksa toote segu) vaid üheksas etapis, samas kui nende eraldi saamiseks oleks vaja sünteesida 27 × 3 = 81 etappi.

Tahkefaasiline süntees ehk tahkefaasitehnoloogia, mida sageli nimetatakse keraamikaks, on kõige levinum anorgaaniliste materjalide tootmisel erinevatele teadus- ja tööstusharudele. Nende hulka kuuluvad tuumakütus, kosmosetehnoloogia materjalid, raadioelektroonika, mõõteriistad, katalüsaatorid, tulekindlad ained, kõrgtemperatuursed ülijuhid, pooljuhid, ferro- ja piesoelektrikud, magnetid, mitmesugused komposiidid ja paljud teised.

Tahkefaasiline süntees põhineb keemilistel reaktsioonidel, milles vähemalt üks reagent on tahke ainena. Selliseid reaktsioone nimetatakse heterogeenseks või tahkeks faasiks. Tahkefaasi interaktsioon, erinevalt reaktsioonidest vedelas või gaasilises keskkonnas, koosneb kahest põhiprotsessist: keemilisest reaktsioonist endast ja aine ülekandest reaktsioonitsooni.

Tahkisreaktsioone, mis hõlmavad kristalseid komponente, iseloomustab nende aatomite või ioonide piiratud liikuvus ja keeruline sõltuvus paljudest teguritest. Nende hulka kuuluvad näiteks reageerivate tahkete ainete keemiline struktuur ja sellega seotud reaktsioonivõime, defektide olemus ja kontsentratsioon, reaktsioonitsooni pinna olek ja morfoloogia, interakteeruvate reaktiivide kokkupuuteala, esialgne mehaaniline keemiline aktiveerimine ja mitmed teised. Kõik ülaltoodu määrab heterogeensete reaktsioonide mehhanismide keerukuse. Heterogeensete reaktsioonide uurimine põhineb tahkiskeemial, keemilisel füüsikal ja tahkete ainete pinna füüsikalisel keemial, termodünaamika ja kineetika seadustel.

Sageli hinnatakse tahkisreaktsioonide mehhanismi ainult selle põhjal, et eksperimentaalseid andmeid interaktsiooni astme kui aja funktsiooni kohta kirjeldatakse kõige paremini mis tahes konkreetse kineetilise mudeli ja vastava kineetilise võrrandiga. Selline lähenemine võib viia valede järeldusteni.

Tahkes olekus materjalides kasutatavatel protsessidel on mitmeid olulisi erinevusi vedelikes või gaasides toimuvatest protsessidest. Need erinevused on seotud ennekõike oluliselt (mitme suurusjärgu võrra) madalama difusioonikiirusega tahketes ainetes, mis takistab komponentide kontsentratsiooni keskmistamist süsteemis ja viib seega toimuvate protsesside ruumilise lokaliseerimiseni. Ruumiline lokaliseerimine viib omakorda selleni, et protsesside vaadeldavale kineetikale aitavad kaasa nii protsessi spetsiifiline kiirus (või difusioonikoefitsient) kui ka reaktsioonitsooni geomeetria. Selliseid geomeetriliste teguritega määratud tahkefaasiliste protsesside tunnuseid nimetatakse topokeemilisteks. Lisaks, kuna käsitletavad teisendused on ruumiliselt lokaliseeritud, saab nende kiirust määrata nii protsesside endi järgi faasipiiril (reaktsiooni juhtimine) kui ka selle liidese mis tahes komponendi tarnimise või toote eemaldamise kiirusega ( s) (difusioonikontroll). Neid lihtsate süsteemide juhtumeid, mille puhul mudeli eeldused on täidetud, saab katseliselt tuvastada teisendusastme ajasõltuvuse vormi järgi. Veel üks tahkete ainete faasimuutuste tunnus on seotud asjaoluga, et uue faasituuma moodustumine tahkes maatriksis põhjustab viimases elastsete pingete ilmnemist, mille energiat tuleb mõnel juhul termodünaamikat arvesse võttes arvesse võtta. nendest transformatsioonidest.

Suur hulk tahkefaasiliste protsesside kineetikat ja sel viisil saadud materjalide mikrostruktuuri mõjutavad tegurid määrab ka nende protsesside liigitustüüpide paljususe. Seega, arvestades süsteemi stabiilsust erinevat tüüpi kõikumiste suhtes, heterogeensed (süsteemide puhul, mis on stabiilsed hõivatud mahu väikeste kõikumiste suhtes ja ebastabiilsed suurte suhtes) ja homogeensed (ebastabiilsete süsteemide puhul väikestele kõikumistele) eristatakse protsesse. Heterogeensete protsesside puhul võib näiteks tuua transformatsioonid, mis kulgevad vastavalt tuumade moodustumise ja kasvu mehhanismile, homogeensete protsesside puhul mõned järjestuse-häire üleminekud ja tahkete lahuste spinodaalne lagunemine.

Heterogeensete protsesside puhul on vaja eristada heterogeenset ja homogeenset tuumastumist heterogeensetest ja homogeensetest protsessidest. Heterogeenne tuumastumine tähendab tuumade moodustumist struktuuridefektidel (sh punktdefektid, dislokatsioonid ja faasipiirid); homogeenne tuumastumine - tuumade moodustumine tahke faasi defektivabas mahus.

Tahkefaasilise transformatsiooni produkti analüüsimisel eristatakse ühefaasilisi ja mitmefaasilisi tuumasid. Mitmefaasiliste tuumade puhul on protsessi produktiks mitmefaasiline koloonia, millel on iseloomulik mikrostruktuur, mille määrab moodustunud faaside piiri pinnaenergia; Seda tüüpi protsesse nimetatakse katkendlikeks, vastupidiselt pidevatele protsessidele ühefaasiliste tuumade moodustumise ja kasvu korral.

Teine viis tahke faasi muundumiste klassifitseerimiseks põhineb algfaasi koostise ja reaktsioonisaaduse koostise võrdlusel. Kui need langevad kokku, räägitakse difusioonivabadest protsessidest ja kui koostis muutub, siis difusioonist. Lisaks on kasulik eristada difusioonita protsessidest kooperatiivseid protsesse (näiteks martensiitsene muundumine), mis toimuvad aatomite samaaegse väikese nihkega algfaasis suures mahus.

Difusioonivabad faasimuutused võivad erineda protsessi käigus muutuvate termodünaamiliste omaduste tüübi poolest.

Esimest tüüpi transformatsioonid on protsessid, mille käigus toimub keemilise potentsiaali derivaatide muutus temperatuuri või rõhu suhtes. See tähendab selliste termodünaamiliste parameetrite nagu entroopia, maht, entalpia ja siseenergia järsk muutus faasisiirde ajal. Teist tüüpi teisenduste käigus keemilise potentsiaali esimesed tuletised intensiivsete parameetrite suhtes ei muutu, küll aga muutuvad kõrgema järgu tuletised (alates teisest). Nendes protsessides toimub süsteemi pideva entroopia ja ruumala korral järsk muutus Gibbsi energia teise tuletisena väljendatud suurustes: soojusmahtuvus, soojuspaisumistegur, kokkusurutavus jne.

Kahe faasi vahelised tahkefaasilised reaktsioonid (kontaktid kolme või enama faasi vahel on ebatõenäolised ja vastavaid protsesse võib kujutada mitme kahefaasilise reaktsiooni kombinatsioonina) on difusiooniprotsessid ja võivad olla kas heterogeensed või homogeensed, nii heterogeense kui ka homogeense tuumaga. . Homogeensed protsessid ja homogeense tuumastumisega protsessid sellistes reaktsioonides on võimalikud näiteks metastabiilse tahke lahuse tekkimisel koos selle järgneva lagunemisega (nn sisemised reaktsioonid). Selliste protsesside näide võib olla sisemine oksüdatsioon.

Termodünaamilise tasakaalu tingimus tahkis-teisenduses, nagu igas muus keemilises muundamises, on lähteainetes ja reaktsioonisaadustes olevate komponentide keemiliste potentsiaalide võrdsus. Kahe tahke faasi koostoimes saab realiseerida näidatud keemiliste potentsiaalide võrdsuse erinevatel viisidel: 1) komponentide ümberjaotumine algfaasis koos tahkete lahuste moodustumisega; 2) erineva kristallstruktuuriga uute faaside moodustumine (mida tegelikult nimetatakse tavaliselt tahkefaasiliseks reaktsiooniks) ja kuna komponendi keemiline potentsiaal mitmefaasilise süsteemi erinevates faasides ei sõltu komponendi kogusest. igas faasis saab tasakaalu saavutada ainult siis, kui täielik transformatsioon algfaasid. Kõige usaldusväärsem teave tahkefaasiliste reaktsioonide mehhanismi kohta saadakse komplekssel kasutamisel, mis võimaldab samaaegselt jälgida mitut reageeriva süsteemi parameetrit, sealhulgas faasi koostist, termilisi efekte, massimuutusi ja palju muud.

Tahkisreaktsioonide termodünaamilise teooria pakkus välja Wagner ja arendas seda edasi Schmalzried, kasutades liitumisreaktsioonide näidet.

Siiani puudub mitmesuguste heterogeensete reaktsioonide ühtne klassifikatsioon. Selle põhjuseks on raskused sellise universaalse klassifikatsiooni aluseks oleva kriteeriumi valimisel. Keemiliste kriteeriumide järgi jagunevad reaktsioonid oksüdatsiooni-, redutseerimis-, lagunemis-, kombineerimis-, vahetus- jne reaktsioonideks. Koos nimetatud kriteeriumiga kasutatakse seda laialdaselt reaktiivide füüsikalise oleku peamise kriteeriumina:

Kõigi heterogeensete reaktsioonide iseloomulik tunnus on olemasolu ja lokaliseerimine reaktsioonitsooni faasipiiril. Reeglina väikese paksusega reaktsioonitsoon eraldab kaks ruumipiirkonda, mis on hõivatud erineva koostisega ainetega. erinevaid omadusi. Reaktsioonitsooni tekke põhjused jagunevad tavaliselt kahte rühma: difusiooniprotsesside suhteline aeglus ja keemilised põhjused. Viimane rühm on tingitud tahke reagendi pinnal või kahe olemasoleva faasi vahelisel liidesel paiknevate aatomite või molekulide kõrgest reaktsioonivõimest. On teada, et tahke või vedela aine pinnal on omadused, mis erinevad kompaktse proovi massiomadustest. See muudab liidese omadused spetsiifiliseks. Just siin toimub kristallide pakkimise oluline ümberkorraldamine, kahe kristallvõre vahelised pinged vähenevad ja keemiline koostis muutub.

Kuna massiülekanne toimub difusiooni teel ja tahkete osakeste difusiooniline liikuvus sõltub selle struktuuri defektidest, võib eeldada, et defektid avaldavad olulist mõju tahkefaasiliste reaktsioonide mehhanismile ja kineetikale. See etapp eelneb liidese liidese reagentide muundamise keemilisele etapile. Seega määrab heterogeensete reaktsioonide kineetika nii keemilise reaktsiooni enda kulgemise iseloom kui ka aine reaktsioonitsooni toimetamise meetod. Vastavalt ülaltoodule piirab reaktsioonide kiirust keemiline etapp (keemiline kineetika) või difusioon (difusioonikineetika). Sellist nähtust täheldatakse tegelikkuses.

Wagneri järgi toimub difusioon ja sellest tulenevalt ka reaktsioon tahketes ainetes peamiselt ioonide ja elektronide liikuvuse tõttu, võre mittetasakaaluseisundi tõttu. Võre erinevad ioonid liiguvad selles erineva kiirusega. Eelkõige on anioonide liikuvus enamikul juhtudel tühine võrreldes katioonide liikuvusega. Seetõttu toimub difusioon ja vastavalt ka reaktsioon tahkestes ainetes katioonide liikumise tõttu. Sel juhul võib erinevalt katioonide difusioon toimuda samas suunas või üksteise suunas. Erinevalt laetud katioonide puhul säilib süsteemi elektroneutraalsus tänu elektronide liikumisele. Erinevalt laetud katioonide liikumiskiiruste erinevuse tõttu tekib süsteemis elektripotentsiaal. Selle tulemusena väheneb liikuvamate ioonide liikumiskiirus ja vastupidi, vähem liikuvate puhul? suureneb. Seega reguleerib tekkiv elektripotentsiaal ioonide difusioonikiirusi. Viimast ja selle poolt määratud kogu tahkisteisendusprotsessi kiirust saab arvutada elektroonilise juhtivuse ja ülekandearvude põhjal. Ilmselgelt on ioonide suunatud difusioon võimalik ainult in elektriväli või kui süsteemis on kontsentratsioonigradient.

Tahkes olekus ainete sünteesil on sageli vaja kontrollida mitte ainult saadud toote keemilist (element- ja faasi) koostist, vaid ka selle mikrostruktuurilist korraldust. Selle põhjuseks on nii keemiliste (näiteks tahkefaasiliste reaktsioonide aktiivsus) kui ka paljude füüsikaliste (magnetilised, elektrilised, optilised jne) omaduste tugev sõltuvus tahke aine struktuurilise ülesehituse omadustest erinevatel hierarhilistel tasanditel. Esimene neist tasanditest hõlmab tahke aine elementaarset koostist ja elementide aatomite vastastikuse paigutuse meetodit ruumis - kristallstruktuuri (või amorfsete tahkete ainete aatomite lähima koordinatsioonikeskkonna tunnuseid), samuti koostist ja punktdefektide kontsentratsioon. Tahke keha ehituse järgmise tasandina võime vaadelda laiendatud defektide jaotust kristallis, mis määrab piirkondade suurused, milles (korrigeerituna punktdefektide olemasoluga) täheldatakse translatsioonisümmeetriat aatomite paigutuses. . Selliseid piirkondi võib pidada täiuslikeks mikrokristallideks ja neid nimetatakse koherentse hajumise piirkondadeks. Rääkides koherentse hajumise piirkondadest, tuleb meeles pidada, et üldiselt ei ole need samaväärsed kompaktsete osakestega, mis moodustavad tahkefaasilise materjali, mis võib sisaldada märkimisväärsel hulgal laiendatud defekte ja järelikult koherentsete piirkondadega. hajumine. Koherentse hajumise piirkondade kokkulangemist osakestega (mida antud juhul nimetatakse üksikdomeeniks) täheldatakse tavaliselt ainult viimaste piisavalt väikeste (alla 100 nm) suuruste puhul. Järgnevaid struktuuritasemeid saab seostada pulbrit või keraamilist materjali moodustavate osakeste kuju ja suurusjaotusega, nende agregatsiooniga, primaarsete agregaatide agregatsiooniga jne.

Tahkefaasiliste materjalide erinevatel rakendustel on ülaltoodud struktuuriomadustele erinevad, sageli vastuolulised nõuded ja seetõttu on vaja erinevaid sünteetilisi meetodeid. Seetõttu on õigem rääkida mitte tahkefaasiliste ainete, vaid tahkefaasiliste materjalide sünteesimeetoditest ja valida igal juhul sünteesimeetod, võttes arvesse saadud toote hilisemat kasutusvaldkonda.

Üldjuhul saab tahkefaasiliste materjalide sünteesimeetodeid klassifitseerida nende kauguse järgi kasutatavate keemiliste protsesside kulgemise termodünaamiliselt tasakaalutingimustest. Vastavalt üldistele seadustele, tingimustes, mis vastavad olekule, mis on tasakaalust võimalikult kaugel, täheldatakse tuuma moodustumise kiiruse märkimisväärset ületamist moodustunud tuumade kasvukiirusest, mis ilmselgelt viib kõige hajutatuma produkti saamiseni. Protsessi läbiviimisel termodünaamilise tasakaalu lähedal toimub juba moodustunud tuumade kasv kiiremini kui uute teke, mis omakorda võimaldab saada jämedateralisi (piiraval juhul ühekristallseid) materjale. Kristallide kasvukiiruse määrab suuresti ka laiendatud (mittetasakaalu) defektide kontsentratsioon neis.

Tahkefaasiline süntees põhineb asjaolul, et tulevase oligomeeri esimene lüli on kovalentselt seotud "ankur" rühmaga H., ahela pikendamine viiakse läbi standardsete kaitstud monomeeridega vastavalt tavalistele lahustes sünteesiks kasutatavatele skeemidele. Kokkuvõtteks. sünteesi etapp. oligomeer lõigatakse N.-st ja puhastatakse sobivate meetoditega. Peamiselt kasutatakse tahkefaasilist sünteesi. polüpeptiidide, oligonukleotiidide ja oligosahhariidide saamiseks.

Polüpeptiidide sünteesi käigus N. naib. laialdaselt kasutatakse stüreeni ja 1-2% divinüülbenseeni kopolümeeri, mida on modifitseeritud dimetoksübensüülkloriidi ankurrühma lisamisega, et kinnitada esimene aminohape (kaitstud NH2 rühmaga) C-otsa, näiteks:

Pärast N-kaitserühma eemaldamist viiakse polüpeptiidahela pikendamine läbi lahuses peptiidide sünteesi standardmeetoditega (vt Peptiidid). Kondenseerivate ainetena Naib. sageli kasutatakse karbodiimiide ​​või muundatakse aminohapped eelnevalt aktivaatoriteks. eetrid.

Oligonukleotiidide sünteesil kasutatakse nukleiinhapetena makropoorseid klaase või silikageeli. Ankurrühm on karboksüülrühm, mis on eraldatud N. spec. "jalg", näiteks:

B-puriin või pürimiidalus

Esimeses etapis kinnitub nukleosiid kandja külge desoksüriboosi 3-hüdroksüülrühma juures, milles asendis 5 olev hüdroksüülrühm on kaitstud dimetoksütritüülrühmaga (CH3OS6H4)2(C6H). 5) C (DMTr); viimase kogus pärast selle eraldamist on kergesti mõõdetav spektrofotomeetriliselt, mis toimib kogusena. kandja laadimisele iseloomulik ja võimaldab teil hinnata saagist oligonukleotiidahela ehitamise järgmistes etappides. Pärast DMTr rühma eemaldamist pannakse ahel kokku, kasutades fosfamiide ​​(fl. I; M. Kaposers, 1980) või fosfonaate (hüdrofosfonaadid) (II; R. Stremberg, 1986):

Tahkefaasilise sünteesi läbiviimiseks on vaja kõrgeid saagiseid (96-99% tasemel) piirkonna igas etapis, samuti tõhusad meetodid sünteesitud aine puhastamine ja eraldamine. ühendused.

Tahke faasi kasutamine võimaldab oluliselt lihtsustada ja kiirendada oligomeeri ahela kasvu iga etappi, kuna lahuses olevate komponentide, kondenseerivate ainete ja kõrvalsaaduste eraldamine saavutatakse reaktsioonide filtreerimise teel. segud ja N. pesemine sobiva lahuste komplektiga. Seega jaguneb oligomeerahela kokkupanemise protsess mitmeks standardseks toiminguks: ahela kasvava otsa deblokeerimine, järgmise kaitstud monomeeri ja kondenseeriva aine doseerimine, selle segu söötmine N. kolonni arvutatud ajaks ja pesemine. N. sobiva lahustiga välja. Monomeerse lüli ülesehitamise tsükkel m. b. automatiseeritud.

Automaadi keskmes lõpuball. süntesaatorid on levinud elektriskeem(vt joonis). Arvukad süntesaatorite mudelid erinevad kolonnide konstruktsiooni ja nende arvu, reaktiivide ja lahustite tarnimise meetodi poolest jne. Juhtimine ja programmeerimine toimub sisseehitatud või kaugarvuti abil.

Automaatseadme skemaatiline diagramm. lõpuball. süntesaatorid (elektriline juhtjoon on tähistatud punktiirjoonega): 1 - monomeeride (M 1 , M n) ja kondenseeriva aine (KA) toitejuhe; 2-realine reagentide (nt oksüdeerivad ained, atsüülivad ained, to-t jne) ja p-lahustite (P 1 , P n) tarnimiseks; 3 - lülitusventiilid; 4-kolonni kandjaga, varustatud jaotusega. ventiil; 5-fotomeetriline kamber; 6-meetrine; 7-juhtimis- ja programmeerimisseade; 8-ekraan.

Tahkefaasilise sünteesi potentsiaali demonstreeris ribonukleaas A (R. Merrifield, 1969) ja inimese kasvuhormooni (D. Yamashiro, 1970) süntees, mille pikkus oli vastavalt 124 ja 183 aminohapet. Kuid peptiidsideme moodustumisel tekkiva väikese, kuid pideva ratsemiseerumise tõttu süntesaator. valkudel on madal biol. tegevus, seega automaatne. süntesaatoreid kasutab Ch. arr. lühikeste polüpeptiidide saamiseks (10-30 linki), sealhulgas preparatiivseteks

Leiutis käsitleb tahke faasi meetodit peptiidi valemiga H-D--Nal--Thr-NH2 sünteesiks, milles kasutatakse nii Boc-kaitstud kui ka Fmoc-kaitstud aminohappeid ja klorometüleeritud polüstüreenvaiku. 10 z.p. f-ly.

Tehnikavaldkond, kuhu leiutis kuulub

Käesolev leiutis käsitleb meetodit peptiidi valmistamiseks, mis sisaldab kolme või enamat aminohappejääki, millel on N-terminaalne aminohape, N-terminaalse aminohappega külgnev eelviimane aminohape ja C-terminaalne aminohape.

Enne kunsti

Tahkefaasilise peptiidi süntees võeti kasutusele 1963. aastal, et ületada paljud peptiidide lahusesünteesiga seotud vahepealsete puhastamisetappide probleemid (Stewart et al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2. väljaanne, 1984). Tahkefaasilise sünteesi puhul koondatakse (nt liidetakse) aminohapped peptiidiks mis tahes soovitud järjestuses, samal ajal kui ahela üks ots (nt C-ots) on seotud lahustumatu kandjaga. Kui soovitud järjestus on kandjale (toele) kokku pandud, siis peptiid vabastatakse (st lõhustatakse) kandjast. Seondatavate aminohapete α-aminorühmade kaks standardset kaitserühma on Boc, mis eemaldatakse tugeva happega, ja Fmoc, mis eemaldatakse alusega. Käesolev leiutis käsitleb mugavat meetodit peptiidide valmistamiseks, kasutades mõlema α-aminorühmade kaitse kombinatsiooni ühes sünteesis odaval klorometüleeritud polüstüreenist valmistatud vaigul.

Tahkefaasilise peptiidi sünteesi kavandamisel, kasutades mis tahes ülaltoodud α-amino kaitseskeeme, on oluline, et kõik peptiidi moodustavate aminohapete reaktiivsed "kõrvalrühmad" oleksid kaitstud ahela kokkupanemise ajal soovimatute keemiliste reaktsioonide eest. Samuti on soovitav, et β-aminorühmade kaitse eemaldamiseks kasutatavad reaktiivid ei eemaldaks erinevate kõrvalrühmade kaitsmiseks valitud keemilisi rühmi. Kolmandaks on oluline, et kasvava peptiidahela side vaiguosakesega oleks reagentide suhtes vastupidav ahela kokkupaneku protsessis, et eemaldada igasugune α-aminokaitse. Fmoc-i kasutava α-amino-kaitseskeemi puhul peab külgrühma kaitse olema vastupidav Fmoc-i eemaldamiseks kasutatud leeliselistele reaktiividele. Praktikas eemaldatakse need kõrvalahela kaitserühmad tavaliselt kergelt happeliste reaktiividega pärast peptiidahela kokkupanemise lõpetamist. Kui kasutatakse Boc-i kasutavat β-aminorühma kaitseskeemi, peab kõrvalrühma kaitse olema vastupidav nõrgalt happelisele reagendile, mida kasutatakse Boc-rühma eemaldamiseks igas tsüklis. Praktikas eemaldatakse need kõrvalahela kaitserühmad β-amino-kaitseskeemis Boc-ga tavaliselt veevaba HF-ga pärast peptiidahela kokkupanemise lõpetamist. Seega ei ole praktikas tavaliselt kasutatavad külgahela kaitserühmad α-amino-kaitseskeemis Fmoc-ga stabiilsed tingimustes, mida kasutatakse α-aminorühmade kaitse eemaldamiseks Boc-ga. Seetõttu ei kombineerita peptiidahela kokkupanemisel tahkefaasilises peptiidisünteesis kahte tüüpi α-aminorühmade kaitseskeeme. Lisaks, kuigi peptiidide sünteesis kasutatavat odavaimat polümeervaiku (klorometüleeritud polüstüreen ehk "Maryfieldi vaik") kasutatakse laialdaselt koos Boc-rühmadega kaitstud aminohapetega, on kirjanduses jõutud järeldusele, et see ei ole kaitse puhul rakendatav. α-aminorühmade Fmoc rühmadega selle ebastabiilsuse tõttu leeliselistes tingimustes (vt Stewart et al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2. väljaanne, 1984). Käesolev leiutis käsitleb meetodit teatud peptiidide kooskasutamiseks nii Boc-kaitstud kui ka Fmoc-kaitstud aminohapete tahkes faasis sünteesis Merifieldi vaigul.

Lanreotide®, mis on somatostatiini analoog, pärsib teadaolevalt kasvuhormooni vabanemist ning inhibeerib ka insuliini, glükagooni ja eksokriinset pankrease sekretsiooni.

USA patendis nr 4 853 371 avaldatakse ja nõutakse Lanreotide®, selle valmistamise meetodit ja meetodit kasvuhormooni, insuliini, glükagooni ja pankrease eksokriinse sekretsiooni inhibeerimiseks.

USA patent nr 5147856 avalikustab Lanreotide® kasutamise restenoosi raviks.

USA patent nr 5411943 avalikustab Lanreotide® kasutamise hepatoomi raviks.

USA patent nr 5073541 avalikustab Lanreotide® kasutamise kopsuvähi raviks.

USA patenditaotlus nr 08/089410, esitatud 9. juulil 1993, avalikustab Lanreotide® kasutamise melanoomi raviks.

USA patent nr 5 504 069 avalikustab Lanreotide® kasutamise tahke kasvaja kiirenenud kasvu pärssimiseks.

USA patenditaotlus nr 08/854941, mis on esitatud 13. mail 1997, avalikustab Lanreotide® kasutamise kehakaalu langetamiseks.

USA patenditaotlus nr 08/854 943, esitatud 13. mail 1997, avalikustab Lanreotide® kasutamise insuliiniresistentsuse ja sündroomi X raviks.

USA patent nr 5688418 avalikustab Lanreotide® kasutamise pankrease rakkude elujõulisuse pikendamiseks.

PCT taotlus nr PCT/US 97/14154 avalikustab Lanreotide® kasutamise fibroosi raviks.

USA patenditaotlus nr 08/855311, esitatud 13. mail 1997, avalikustab Lanreotide® kasutamise hüperlipideemia raviks.

USA patenditaotlus nr 08/440061, esitatud 12. mail 1995, avalikustab Lanreotide® kasutamise hüperamülineemia raviks.

USA patenditaotlus nr 08/852221, esitatud 7. mail 1997, avalikustab Lanreotide® kasutamise hüperprolaktineemia ja prolaktinoomide raviks.

Leiutise olemus

Käesolev leiutis pakub meetodi kolme või enamat aminohappejääki sisaldava peptiidi valmistamiseks, millel on N-terminaalne aminohape, N-terminaalse aminohappega külgnev eelviimane aminohape ja C-otsa aminohape, nimetatud meetod hõlmab järgmised sammud:

(a) esimese aminohappe kinnitamine tahke tugivaigu külge eetersidemega, et moodustada esimene sidestusprodukt, mis hõlmab (i) tseesiumkarbonaadi vesilahuse reageerimist esimese aminohappe alkoholilahusega, et moodustada tseesiumisool esimese aminohappe tseesiumisoola saamine, (ii) esimese aminohappe lahustivaba tseesiumisoola saamine, (iii) tahke tugivaigu reageerimine esimese aminohappe tseesiumisoolaga kuivas (veevabas) polaarses aprotoonses lahustis. esimene lisatoode,

kus esimene aminohape vastab peptiidi C-otsa aminohappele, blokeerib Boc esimese aminohappe mitte-külg- (põhi-) ahela aminorühma ja esimesel aminohappel ei ole funktsionaalrühma külgahelas, mis vajab kaitset, ja tahke tugi - vaik - on klorometüleeritud polüstüreeni vaik;

b) kaitse eemaldamine (deblokeerimine) Boc esimese liitumise produktilt happega, et moodustada esimese liitumisprodukti deblokeeritud toode;

(c) valikuliselt järgmise aminohappe kinnitamine deblokeeritud esimese kinnitusproduktiga, mis hõlmab järgmise aminohappe reageerimist deblokeeritud esimese kinnitusproduktiga orgaanilises lahustis, mis sisaldab peptiidide kasvureagenti, et saada blokeeritud (kaitstud) järgmine kinnitusprodukt, kus järgmise aminohappe peaahelas on Boc poolt blokeeritud aminorühm ja kui järgmise aminohappe kõrvalahelas on üks või mitu funktsionaalrühma, siis kõrvalahela funktsionaalrühmad ei vaja kaitset või funktsionaalrühmad külgahelas on kaitserühmad, mis on resistentsed kaitse eemaldamiseks kasutatavate happeliste või aluseliste reaktiivide suhtes, vastavalt Boc ja Fmoc;

(d) Boc kaitse eemaldamine blokeeritud järgmisest aduktist, mis hõlmab järgmise blokeeritud adukti reageerimist happega, et saada järgmine deprotekteeritud adukt;

(e) valikuliselt sammude (c) ja (d) kordamine, kusjuures iga tsükkel genereerib järgmise (X+1)-nda kinnituse vabastatud produkti, kus X on tsükli nõutava korduse arv;

(f) järgmise aminohappe lisamine etapi (b) vabanenud esimesele kinnitusproduktile või valikuliselt etapi (e) vabanenud (X+1) järgmisele kinnitusproduktile, mis hõlmab järgmise aminohappe reageerimist nimetatud ühendiga. esimese kinnitusproduktiga või (X+1) järgmise kinnituse määratletud deblokeeritud produktiga orgaanilises lahustis, mis sisaldab reaktiivi peptiidi kasvatamiseks, et saada blokeeritud (kaitstud) järgmine kinnitusprodukt, ja järgmisel aminohappel on põhiahel Fmoc poolt blokeeritud aminorühm eeldusel, et kui järgmise aminohappe kõrvalahelas on üks või mitu funktsionaalrühma, siis külgahela funktsionaalrühmad ei vaja kaitset või kõrvalahela funktsionaalrühmadel on kaitserühmad, mis on vastupidav leeliselistele reaktiividele, mida kasutatakse Fmoc kaitse eemaldamiseks;

(g) Fmoc kaitse eemaldamine blokeeritud järgmiselt aduktilt, mis hõlmab järgmise blokeeritud adukti reageerimist primaarse või sekundaarse amiiniga, et saada järgmine deprotekteeritud adukt;

(h) valikuliselt korrates samme (e) ja (g), kusjuures iga tsükkel genereerib (X+1) järgmise lisamise deblokeeritud korrutise, kus X on tsükli vajaliku korduse arv kuni eelviimaseni. sisaldub peptiidis ja deblokeeritud aminohappes;

(i) N-otsa aminohappe kinnitamine deprotekteeritud (X+1) järgmise liitumisprodukti külge, mis hõlmab N-terminaalse aminohappe reageerimist kaitsmata (X+1) järgmise liitumisproduktiga orgaanilises lahustis, mis sisaldab peptiidide kasvureagenti, et saada blokeeritud lõpp-produkt, milles N-terminaalsel aminohappel on Boc või Fmoc poolt blokeeritud aminorühm;

(j) Boc või Fmoc kaitse eemaldamine blokeeritud lõpetatud liitprodukti eest, mis hõlmab blokeeritud lõpetatud liitprodukti reageerimist happega Boc puhul või alusega Fmoc puhul, et moodustada vaigul valmis peptiidprodukt;

(j) kui vaigul oleval valmis peptiidsaadusel on kõrvalahela funktsionaalrühmad, siis valikuliselt eemaldatakse vaigul oleva valmis peptiidprodukti kõrvalahela funktsionaalrühmade kaitserühm, mis hõlmab vaigul oleva valmis peptiidsaaduse reageerimist sobivate kaitse eemaldamise reagentidega, et saada vaigul. valmis peptiidprodukt vaigul eemaldatud kaitse; Ja

(k) peptiidi eraldamine vaigul oleva valmis peptiidsaaduse või deprotekteeritud vaigul oleva valmis peptiidsaaduse tahke vaigu kandja küljest peptiidi saamiseks, mis hõlmab vaigul oleva valmis peptiidsaaduse või kaitsmata vaigul oleva valmis peptiidsaaduse reageerimist ammoniaagiga , primaarne amiin või sekundaarne amiin kuni peptiidi vaigust lõhustamise praktilise lõpuleviimiseni;

tingimusel, et peptiidi sünteesi etapid (e) ja (g) tuleb läbi viia vähemalt üks kord.

Eelistatud on käesolevale leiutisele vastav protsess, kus ammoniaak, primaarne amiin või sekundaarne amiin etapis (k) on lahustis, mis sisaldab alkoholi ja valikuliselt aprotoonset polaarset lahustit,

Eelistatud on käesolevale leiutisele vastav meetod, kus etapp (l) sisaldab lisaks järgmisi etappe:

lõhustatud peptiidi sadestamine lahustist;

tahke vaigukandja ja sadestunud peptiidi eraldamine filtrimisega ning

peptiidi ekstraheerimine happelise lahusega peptiidi eraldamiseks.

Eelistatud on käesolevale leiutisele vastav meetod, kus esimene aminohape on Boc-L-Thr.

Eelistatud on käesolevale leiutisele vastav meetod, milles esimene aminohape on Boc-L-Thr tseesiumisool, mis annab esimese sidestusproduktina Boc-L-Thr vaigu, ja esimene deblokeeritud sidestusprodukt on H-L-Thr vaik. .

Eelistatud on käesolevale leiutisele vastav protsess, milles Boc-kaitserühma eemaldamiseks etapis (etappides) kasutatav hape on trifluoroäädikhape (TFA).

Eelistatud meetod, mis on seotud vahetult eelneva protsessiga, on selline, kus orgaaniliseks lahustiks on metüleenkloriid, kloroform või dimetüülformamiid ja peptiidi kasvureagendiks on diisopropüülkarbodiimiid, ditsükloheksüülkarbodiimiid või N-etüül-N"-(3-dimetüülaminopropüül)karbodiimiid .

Eelistatud meetod, mis on seotud vahetult eelneva meetodiga, on meetod, mis hõlmab etappide (e) ja (g) läbiviimist kuus korda pärast deblokeeritud esimese sidestusprodukti valemiga H-L-Thr-vaigu moodustumist, kus järgnevad aminohapped lisatud järjekorras: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) ja Fmoc-L- Cys(Acm) saaduse H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-vaigu moodustamiseks.

Eelistatud meetod, mis on seotud vahetult eelneva meetodiga, on meetod, mis hõlmab Boc-D--Nal lisamist H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-. Cys(Acm)-Tnr-vaik vastavalt etapile (c), et saada Boc-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Ast) -Thr-vaik.

Eelistatud meetod, mis on seotud vahetult eelneva meetodiga, hõlmab Boc-Nal-i kaitsva Boc-rühma, Tyr-i kaitsva O-t-Bu-rühma ja Lys-i kaitsva Boc-rühma samaaegset eemaldamist Boc-D--Nal-Cys-s (Acm). )-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-vaik vastavalt etapile (i), et saada valmis peptiidprodukt vaigul valemiga H-D-- Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-vaik.

Eelistatud meetod, mis on seotud vahetult eelneva meetodiga, hõlmab H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr peptiidi lõhustamist tahkest vaigust. reaktsioon H-D-βNal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm)-Thr-vaiguga ammoniaagiga lahustis, mis sisaldab alkoholi ja valikuliselt aprotoonset polaarset lahustit, et kõrvaldada praktiliselt täielikult, et saada H-D --Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2.

Eelistatav protsess, mis on seotud vahetult eelneva protsessiga, on selline, kus alkoholiks on metanool ja polaarseks aprotoonseks lahustiks on dimetüülformamiid.

Eelistatud meetod, mis on seotud vahetult eelneva meetodiga, hõlmab samaaegset Acm-i kaitsvate Cys-rühmade eemaldamist ja tulemuseks olevate kaitsmata Cys-jääkide tsükliseerimist valmis peptiidisaaduses valemiga H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D -Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2, viies läbi H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH reaktsiooni 2 joodi lahusega alkoholis kuni peaaegu täieliku kaitserühma eemaldamise ja tsükliseerimiseni, et saada H-D--Nal--Thr-NH2.

Eelistatud meetod, mis on seotud vahetult eelneva meetodiga, on meetod, kus peptiid on H-D--Nal--Thr-NH2.

Eelistatud meetod, mis on seotud vahetult eelneva meetodiga, on selline, kus peptiid on somatostatiini analoog.

Käesoleva leiutise kirjelduses kasutatud terminid on defineeritud järgmiselt:

"esimene aminohape": hõlmab mis tahes aminohapet, mille peaahelas (mitte kõrvalahelas) olev aminorühm on kaitstud Boc-ga, mis on kaubanduslik toode või mida saab sünteesida tavaliste oskustega inimesele tuntud meetoditega. tehnika tasemes, näiteks Boc-L-Thr;

"esimene kinnitusprodukt": kirjeldab toodet, mis on kinnitatud tahkele kandevaigule, mis tuleneb esimese aminohappe lisamisest tahkele kandevaigule, nt Boc-L-Thr vaigule;

"deblokeeritud esimene sidestusprodukt": kirjeldab toodet, mis on saadud Boc-rühma eemaldamisel või eemaldamisel esimesest sidestusproduktist – näiteks H-L-Thr-vaik, kus "H" on põhirühma aminorühma saadaolev vesinik. ahel, mis tuleneb kaitse eemaldamise etapist;

"järgmine aminohape": kirjeldab mis tahes aminohapet, mille peaahela aminorühm on kaitstud Boc või Fmoc-ga, mis on kaubanduslikult saadaval või mida saab sünteesida vastava ala asjatundjale tuntud meetoditega. Kuna etapp (c) ja etapp (e) võivad sisalduda korduvas tsüklis, kus etapp viiakse läbi rohkem kui üks kord, iga kord, kui etapp (c) või etapp (e) sooritatakse, võib "järgmise aminohappe" sõltumatult valida järgmistest: rühm, mis on teadaolevalt või tõenäoliselt sünteesitud aminohapped, milles peaahela aminorühm on kaitstud Boc või Fmoc-ga;

"(X+1)-nda järgmise liitumise blokeeritud toode": kirjeldab tahke tugivaigu külge kinnitatud toodet, mis on järgmise aminohappe ja "järgmise liitumise deblokeeritud produkti" tulemus. Kuna etapid (c) ja (d) ning etapid (e) ja (g) võivad olla kaasatud korduvasse tsüklisse, kus saab siduda järgmisi aminohappeid, kasutatakse terminit "(X+1) järgmise kinnituse blokeeritud saadus". viitab tootele, mis on saadud iga eelneva ühinemistsükli tulemusena;

"(X+1) järgmise liitumise blokeerimata toode": kirjeldab toodet, mis tuleneb Fmoc-rühma eemaldamisest "järgmise (X+1)-nda liitumise blokeeritud tootest";

"täielik peptiidsaadus vaigul": kirjeldab peptiidprodukti, mis on kinnitatud tahke tugivaigu külge pärast seda, kui N-otsa aminohape on kinnitatud peptiidahelaga ja pärast seda, kui N-terminaalse aminohappe karkassi aminorühm on kaitstud või deblokeeritud. , kuid millel on veel külgahelate funktsionaalrühmadel kaitsvad rühmad, mida reaktsioon ei eemalda, teostades kaitserühma eemaldamise N-terminaalse aminohappe põhiahelast; Ja

"täielik peptiidsaadus deprotekteeritud vaigul": kirjeldab peptiidprodukti, mis on kinnitatud tahke vaigu kandja külge, kus kõik kaitserühmad on aminohapete kõrvalahelate funktsionaalrühmadest eemaldatud või kaitstud.

Hapete näideteks, mida saab kasutada Boc kaitse eemaldamiseks, on trifluoroäädikhape (TFA), metaansulfoonhape ja HCl-i sisaldavad orgaanilised lahused.

Fmoc kaitse eemaldamiseks kasutatavate primaarsete ja sekundaarsete amiinide näited on 4-(aminometüül)piperidiin, piperidiin, dietüülamiin, DBU ja tris(2-aminoetüül)amiin.

Näited mittenukleofiilsetest alustest, mida saab kasutada vabastatud aminorühmade TFA soolade neutraliseerimiseks (RNH 3 + CF 3 COO – need soolad tuleb enne järgmise aminohappe lisamist või selle ajal muuta "vabadeks" amiinideks (NH 2) , vastasel juhul lisamist ei toimu) on diisopropüületüülamiin (DIEA) ja trietüülamiin (TEA).

Aminohapete lisamisreaktsioonides kasutatavate orgaaniliste lahustite näideteks on metüleenkloriid, kloroform, dikloroetaan, dimetüülformamiid, dietüülatseetamiid, tetrahüdrofuraan, etüülatsetaat, 1-metüül-2-pürrolidoon, atsetonitriil või nende lahustite kombinatsioon.

Peptiidi pikendajate näidete hulka kuuluvad asendatud karbodiimiidid, nagu diisopropüülkarbodiimiid, ditsükloheksüülkarbodiimiid või N-etüül-N'-(3-dimetüülaminopropüül)karbodiimiid.

Karboksüülrühmi ja aminorühmi, mis osalevad peptiidamiidsideme moodustamises, nimetatakse vastavalt "külgahela" karboksüülrühmaks või aminorühmaks. Teisest küljest nimetatakse mis tahes aminohappe funktsionaalrühmi, mis ei osale peptiidamiidsideme moodustamises, "külgahela" funktsionaalrühmadeks.

Mõiste "aluseresistentne rühm" viitab kaitserühmadele, mida kasutatakse aminohapete funktsionaalrühmade kaitsmiseks, mis (1) on aluse suhtes resistentsed, nt mida ei saa eemaldada selliste alustega nagu 4-(aminoetüül)piperidiin, piperidiin või tris(2). -aminoetüül)amiin, mis on tavaliselt Fmoc-kaitserühma eemaldamiseks kasutatavad alused, ja (2) saab eemaldada happega nagu trifluoroäädikhape või mõne muu meetodiga, nagu katalüütiline hüdrogeenimine.

Sümboleid "Fmoc" ja "Boc" kasutatakse siin ja kaasnevas valemis vastavalt 9-fluorenüülmetoksükarbonüüli ja t-butüüloksükarbonüüli tähistamiseks.

Ülalkirjeldatud meetodit saab kasutada peptiidide, eelistatavalt somatostatiini analoogide, nagu Lanreotide® oktapeptiid, valmistamiseks, mille valem on järgmine: H-D--Nal--Thr-NH2. Kui sünteesitakse H-D--Nal--Thr-NH2, võivad Cys-, Lys- ja Tyr-külgahela funktsionaalrühmade kaitsmiseks kasutatavad aluseresistentsed kaitserühmad olla vastavalt atsetamidometüül (Acm), Boc ja tert-butüül. Asm on eelistatud Cysile.

Somatostatiini analoogi all mõeldakse peptiidi, millel on somatostatiiniga sarnane (st agonist) või vastupidine (st antagonist) bioloogiline aktiivsus.

Valemis H-D--Nal--Thr-NH2 viitab iga tavaline kolmetäheline aminohappe sümbol (nt Lys) struktuursele aminohappejäägile. Näiteks sümbol Lys ülaltoodud valemis tähistab -NH-CH((CH2)4NH2)-CO-. Sümbol D--Nal- tähistab aminohappejääki D-2-naftüülalanilüüli. Sulgud tähistavad disulfiidsidet, mis seob peptiidis kahe Cys jäägi vabad tioolid, mis näitab, et sulgudes olevad peptiidi aminohapped moodustavad tsükli.

Siin antud kirjelduse põhjal saab vastava ala asjatundja käesolevat leiutist kõige täielikumalt kasutada.

Kui ei ole teisiti määratletud, on kõigil siin kasutatud tehnilistel ja teaduslikel terminitel sama tähendus, mida käesoleva leiutisega seotud ala asjatundjad tavaliselt mõistavad. Lisaks on kõik siin tsiteeritud publikatsioonid, patenditaotlused, patendid ja muud viited lisatud siia viitena neile.

Peptiidi saab valmistada käesoleva leiutise meetodi kohaselt vastavalt järgmisele protseduurile.

0,5 moolekvivalendi tseesiumkarbonaadi lahus vees lisatakse aeglaselt 1 moolekvivalendi Boc-AA 1 lahusele (Bachem California, Torrance, CA), kus AA 1 vastab C-otsa aminohappele, mis on lahustatud alkoholis, eelistatavalt metanool. Saadud segu segati umbes 1 tund toatemperatuuril, seejärel eemaldati kogu alkohol ja kogu vesi alandatud rõhul, et saada Boc-AA1 tseesiumisoola kuiv pulber. Merifieldi vaiku, 1,0 ekvivalenti (kloormetüleeritud polüstüreen, 200-400 mešši, kloriidioonide osakaal 1,3 mekv/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky või Polymer Laboratories, Church Stretton, Inglismaa) pestakse klooritud lahustiga (eelistatult diklorometaaniga). ), alkohol, eelistatavalt metanool, ja polaarne aprotoonne lahusti, eelistatavalt dimetüülformamiid (DMF). Tseesiumisoola Boc-AA1 pulber lahustatakse veevabas (kuivas) polaarses aprotoonses lahustis, eelistatavalt DMF-is, ja lahus ühendatakse eelnevalt pestud vaiguga. Suspensiooni segatakse õrnalt temperatuuril umbes 45-65 °C, eelistatavalt temperatuuril 50-60 °C, umbes 48 kuni 106 tundi, eelistatavalt 85 kuni 90 tundi, inertses atmosfääris nagu lämmastik. Vaik eraldatakse filtrimisega ja pestakse põhjalikult polaarse aprotoonse lahustiga, eelistatavalt DMF, veega ja lõpuks alkoholiga nagu MeOH. Boc-AA1 vaik kuivatatakse alandatud rõhul.

Boc-AA 1 -vaik sisestatakse klaasreaktorisse, mille filtripõhi on valmistatud jämedast sulatatud klaasist. Vaik pestakse klooritud lahustiga, nagu DCM, blokeeringud eemaldatakse orgaanilise happega, eelistatavalt 25% TFA-ga DCM-s, pestakse korraks klooritud lahusega, nagu DCM, ja alkoholiga nagu MeOH, neutraliseeritakse orgaanilise alusega, eelistatavalt trietüülamiiniga. DCM-i ja pesti uuesti DCM-i ja polaarse aprotoonse lahustiga, nagu DMF, et saada deprotekteeritud AA1 vaik.

Seejärel kinnitatakse deprotekteeritud AA1 vaigule valikuliselt mis tahes soovitud arv aminohappeid. Kui järgmisel aminohappel on Fmoc-kaitsega α-aminorühm (Fmoc-AA x), siis külgahela rühm kas ei vaja kaitset (näiteks Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe või Fmoc- Thr) või külgahel kaitseb alusekindla rühmaga. Fmoc-AA x molaarne liig (kus x on aminohappe positsiooninumber peptiidis, loendatuna C-otsast) kinnitatakse ligikaudu 60 minutiks kaitsmata AA1 vaigu külge peptiidi kasvureagendiga nagu diisopropüülkarbodiimiid. (DIC) DCM/DMF segus. Lisatud vaiku pesti DMF-i, alkoholi ja DCM-ga, saades Fmoc-AA x-AA1 vaigu. Kinnitust saab kontrollida Kaiseri ninhüdriini meetodil. Seejärel pestakse Fmoc-AA x -AA1 vaiku üks kord DMF-ga ja seejärel deblokeeritakse aluse lahusega orgaanilises lahustis, nagu piperidiin DMF-s, et saada AA x -AA1 vaik. Seejärel pestakse AA x-AA 1 vaiku DMF-ga, millele järgneb mitu korda nii alkoholiga nagu MeOH ja DCM pesemine. Seejärel pestakse AA x-AA1 vaiku üks kord DMF-ga umbes 3 minutit, kolm korda isopropanooliga, eelistatavalt iga kord umbes 2 minutit, ja kolm korda DCM-iga, eelistatavalt iga kord umbes 2 minutit. Seejärel on vaik valmis kas Fmoc-kaitstud aminohappe, nagu eespool kirjeldatud, või Boc-kaitstud aminohappe, nagu allpool kirjeldatud, edasiseks kinnitamiseks.

Samamoodi, kui mis tahes järgnev aminohape, mis kinnitatakse deprotekteeritud AA1 vaigule, valitakse kaitstud Boc-aminorühmaga (Boc-AA x), pole kõrvalahela rühma kaitsmine vajalik (see võib olla Boc-Gly , Boc-Ala, Boc-Phe või Boc-Thr) või külgahel peab olema kaitstud rühmaga, mis on vastupidav nii happe kui ka aluse eemaldamisele, milleks võib olla Boc-Cys(Acm). Kui valitakse Boc-AA x, kasutatakse selle kinnitamiseks samu reagente ja lahusteid, mida on kirjeldatud ülal Fmoc-aminohapete puhul, ning kinnitamise täielikkust (lõpetamist) saab kontrollida Kaiseri ninhüdriini meetodil. Seejärel eemaldatakse Boc-AA x -AA1 vaigu kaitse happelahusega orgaanilises lahustis, nagu TFA DCM-s, et saada CF3CO-H+-AA x-AA1 vaik. Seejärel pestakse seda vaiku mitu korda klooritud lahustiga, nagu DCM, alkoholiga, nagu MeOH, ja neutraliseeritakse mittenukleofiilse alusega, nagu trietüülamiin DCM-is, ja seejärel pestakse veel mitu korda klooritud lahustiga nagu DCM, et saada. AA x -AA 1 - vaik. Seejärel on vaik valmis kaitstud Boc või Fmoc aminohappe edasiseks kinnitamiseks, nagu ülalpool kirjeldatud.

Sõltuvalt peptiidi soovitud järjestusest ja kasutatava α-amino-kaitstud aminohappe tüübist (kas kaitstud Fmoc või Boc-ga), kasutatakse ülaltoodud kinnitusprotseduuride sobivat kombinatsiooni, sõltuvalt sellest, milline aminohape peab aset leidma peptiidjärjestus - kõrvalahel, millel on kaitserühm, mida saab eemaldada kas alusega, mis on vajalik Fmoc eemaldamiseks a-aminorühmast, või happega, mis on vajalik Boc eemaldamiseks a-aminorühmast. Selline kaitstud aminohape võib olla N-β-Boc-N'-β-Fmoc-lüsiin või N-β-Fmoc-N'-β-Boc-lüsiin. Sel juhul peavad kõik järgnevate aminohapete α-aminorühmade selekteeritavad kaitserühmad kuni N-otsa aminohappeni ühilduma selle positsiooni jaoks valitud kõrvalrühma kaitsega. See tähendab, et külgahela kaitserühmad peavad olema resistentsed deblokeeriva aine suhtes, mida kasutatakse järgnevate aminohapete a-aminorühmade kaitse eemaldamiseks. N-terminaalse aminohappe puhul võib α-aminokaitsena kasutada kas Boc või Fmoc, kuna N-terminaalse aminohappe kaitse eemaldamine võib samaaegselt deprotekteerida mõned kaitstud kõrvalahelad, ilma et see mõjutaks soovimatult peptiidi sünteesi strateegiat, kuna aminohapped on enam saadaval.

Valmis peptiidahel, mis on endiselt vaigu küljes, tuleb eemaldada ja vabastada. Kõigi aluse suhtes resistentsete kaitserühmade ja N-otsa aminohappe α-aminoblokeeriva rühma eemaldamiseks, kui see on asjakohane, töödeldakse vaigul olevat peptiidi happega orgaanilises lahustis, näiteks TFA-s DCM-is. Happekindlate kaitserühmade ja N-otsa aminohappe α-aminoblokeeriva rühma eemaldamiseks, kui see on asjakohane, töödeldakse vaigul olevat peptiidi orgaanilise alusega, näiteks piperidiiniga DMF-s. Alternatiivselt võib happekindlaid rühmi säilitada kuni nende eemaldamiseni pärast peptiidi järgnevat lõhustamist ammoniaagi või amiinalusega. Seejärel pestakse deprotekteeritud vaigul olevat peptiidi klooritud lahustiga, nagu DCM, ja alkoholiga, nagu MeOH, ja kuivatatakse alandatud rõhul konstantse massini.

Peptiid lõigatakse vaigu küljest lahti ja C-ots muudetakse amiidiks, suspendeerides peptiidi vaigul 3:1 MeOH/DMF-s. Suspensioon jahutatakse lämmastikuatmosfääris temperatuurini alla umbes 10 °C ja lahusti pinna alla juhitakse veevaba ammoniaaki, kuni lahus on sellega küllastunud, samal ajal kui temperatuur hoitakse alla umbes 10 °C. Suspensiooni segatakse õrnalt umbes 24 tundi, lastes samal ajal temperatuuril tõusta umbes 20 °C-ni. Reaktsiooni lõpulejõudmise astet kontrollitakse metüülestri vaheühendi kadumisega HPLC-s sobivates tingimustes, sõltuvalt peptiidi tüübist. reaktsioonisegu jahutage ja lisage vajalik kogus veevaba ammoniaaki, kuni metüülestrile vastav HPLC piigi pindala on väiksem kui 10% sihtsaaduse piigi pindalast. Suspensioon jahutatakse temperatuurini alla umbes 10 °C ja segamist jätkatakse peptiidi sadestamiseks öö läbi. Sade ja vaik eraldatakse filtrimisega ja pestakse külma MeOH-ga. Sade ja vaik kuivatatakse alandatud rõhul, produkt ekstraheeritakse vaigust äädikhappe vesilahusega.

Kui peptiid sisaldab oma järjestuses kaitstud Cys jääke, saab tioolrühmade kaitserühmad eemaldada ja jäägid tsüklistada vastavalt järgmisele protseduurile. Cys kaitstud Asm rühmi sisaldav peptiid lahustatakse lämmastikuatmosfääris äädikhappe vesilahuses. Lahust segatakse kiiresti ja ühe portsjonina lisatakse joodi lahus alkoholis. Segu segatakse ja täielikku kaitserühma eemaldamist kontrollitakse HPLC-ga. Seejärel reaktsioon peatatakse tiitrimisega 2% naatriumtiosulfaadi lahusega, kuni lahuse värvus kaob. Toorsegu puhastati preparatiivse kromatograafiaga C8 kassetil atsetonitriili gradiendiga 0,1 ammooniumatsetaatpuhvris, soolast eemaldati C8 padrunil atsetonitriili gradiendiga 0,25 N äädikhappes ja lüofiliseeriti, et saada sihtpeptiid.

Leiutise näidisteostus

Järgnev näide on toodud käesoleva leiutise meetodi illustreerimiseks ja seda ei tohiks tõlgendada selle ulatust piiravana.

Näide 1. H2-D--Nal--Thr-NH2

A) Boc-L-Thr-vaik

2,58 g tseesiumkarbonaadi lahus 2,5 ml vees lisati aeglaselt 3,48 g Boc-L-treoniini (Bachem California, Torrance, CA) lahusele, mis oli lahustatud 7 ml metanoolis. Saadud segu segati umbes 1 tund toatemperatuuril, seejärel eemaldati kogu metanool ja kogu vesi alandatud rõhul, et saada Boc-L-treoniini tseesiumisoola kuiv pulber. 10 g Maryfieldi vaiku (klorometüleeritud polüstüreen, 200–400 mešši, kloorisisaldus 1,3 mekv/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky) pesti diklorometaani (DCM), metanooli (MeOH) ja dimetüülformamiidiga (DMF) (igaüks 702 korda) ml). Boc-L-treoniini tseesiumisoola pulber lahustati 60 ml kuivas DMF-s ja lahus ühendati ülalkirjeldatud viisil pestud vaiguga. Suspensiooni segati õrnalt temperatuuril ligikaudu 50-60 °C ligikaudu 85 kuni 90 tundi lämmastikuatmosfääris. Vaik eraldati filtrimisega ja pesti põhjalikult DMF-i, deioniseeritud vee ja lõpuks MeOH-ga. Boc-treoniinvaiku kuivatati alandatud rõhul ligikaudu 40 °C juures. Treoniini sisaldus oli 0,85 ± 0,15 mekv/g kuiva vaigu kohta.

B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-vaik

2,0 g etapis (A) saadud Boc-treoniini vaiku viidi 50 ml klaasreaktorisse, millel oli jäme sulatatud klaasist filtripõhi (koormus 1,74 mmol). Vaiku pesti 2 korda DCM-ga (20 ml), iga kord umbes 5 minutit, blokeeriti 25% TFA-ga DCM-s (30 ml) – esimest korda umbes 2 minutit ja teist korda umbes 25 minutit, pesti 3 korda. korda umbes 2 minutit DCM (20 ml), isopropanool (20 ml) ja DCM (20 ml), neutraliseeriti kaks korda umbes 5 minuti jooksul 10% trietüülamiiniga DCM-s (20 ml), pesti 3 korda umbes 2 minutit DCM-ga ja pesti üks kord DMF-ga (20 ml) umbes 5 minutit.

Deblokeeritud vaigule lisati 1,8 g (4,35 mmol, 2,5 ekv.) Fmoc-L-tsüsteiini (Acm) (Bachem, CA) ja 683 μl (4,35 mmol, 2,5 ekv.) diisopropüülkarbodiimiidi (DIC) 14-s. ml 2:1 DCM/DMF umbes 1 tund.Pärast lisamist pesti vaiku üks kord umbes 3 minutit DMF-ga (20 ml), 3 korda umbes 2 minutit 2 minuti DXM-ga (20 ml). Seondust kontrolliti Kaiseri nihüdriini meetodil.

Pärast kinnitamist pesti vaiku üks kord DMF-ga ja seejärel eemaldati blokeeringud piperidiini lahusega DMF-s. Seejärel pesti deblokeeritud vaiku DMF-ga ja mitu korda samaaegselt MeOH ja DCM-ga. Sidevaiku pesti 1 kord umbes 3 minutit DMF-ga (20 ml), 3 korda umbes 2 minutit isopropanooliga (20 ml) ja 3 korda DCM-ga (20 ml) iga kord umbes 2 minuti jooksul. Seondust testiti Kaiseri ninhüdriini meetodil.

Kõik järgmised kaitstud aminohapped kinnitati pestud vaigule, kasutades DIC-d DMF/DCM-is ja vabastati ülalkirjeldatud viisil järgmises järjestuses: Fmoc-L-valiin, Fmoc-L-lüsiin (Boc), Fmoc-D-trüptofaan, Fmoc-L-türosiin (O-t-Bu) ja Fmoc-L-tsüsteiin (Acm) (kõik Bachem Californiast), Boc-D-2-naftüülalaniin (Synthethech, Albany, OR).

Valmis peptiidahel deblokeeriti ja kaitsti kaks korda 75:20:5 DCM/TFA/anisooliga (30 ml) umbes 2 minutit ja umbes 25 minutit, pesti kolm korda umbes 2 minutit iga kord DCM (20 ml) ja isopropanooliga. (10 ml) ja DCM (20 ml), neutraliseeriti 2 korda umbes 5 minutit 10% trietüülamiiniga DCM-s (20 ml) ja pesti 3 korda umbes 2 minutit DCM (20 ml) ja MeOH-ga (20 ml). Vaik kuivatati alandatud rõhul. Kuivmass oli 3,91 g (103% teoreetilisest saagisest).

B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2

2,93 g etapis (B) saadud peptiidiga laetud vaiku (1,3 mmol-ekv.) suspendeeriti 50 ml 3:1 MeOH/DMF segus. Suspensioon jahutati lämmastikuatmosfääris temperatuurini alla umbes 10 °C ja puhuti läbi kuiva ammoniaagigaasi, kuni lahus oli sellega küllastunud, hoides samal ajal temperatuuri alla umbes 10 °C. Suspensiooni segati õrnalt umbes 24 tundi, lastes temperatuuril tõusta umbes 20 °C-ni. Reaktsiooni lõpulejõudmise astet kontrolliti metüülestri vaheühendi kadumise järgi, kasutades HPLC-d (VYDAC® sorbent, tera suurus 5 μm, pooride suurus 100 Å, C18, elueerimine isokraatilistes tingimustes 26% CH3CN 0,1% TFA-s, kiirus 1 ml/min, registreerimine 220 mm juures; sellistes tingimustes aeglustusaeg Rt ~ 14 min metüülestri ja ~ 9,3 min amiidi puhul). Reaktsioonisegu jahutati ja lisati liig veevaba ammoniaaki, kuni metüülestrile vastav piigi pindala HPLC järgi oli alla 10% soovitud produkti piigi pindalast. Suspensioon jahutati temperatuurini alla ligikaudu 10 °C, segamist jätkati peptiidi sadestamiseks öö läbi. Sade ja vaik eraldati filtrimisega ja pesti 15 ml külma MeOH-ga. Sade ja vaik kuivatati alandatud rõhul, produkt ekstraheeriti vaigust 50% äädikhappe vesilahusega (3 x 30 ml). HPLC analüüs näitas, et segus on 870 mg (0,70 mmol) nimiühendit (puhtus isokraatlikus HPLC süsteemis 96%).

D) H-D--Nal--Thr-NH2

500 mg (0,40 mmol) etapis (B) saadud peptiidi lahustati 300 ml 4% äädikhappes ja kuumutati lämmastikuatmosfääris umbes 55 °C-ni. Lahust segati kiiresti ja ühe portsjonina lisati 2% (mass/maht) joodi lahus 7,7 ml MeOH-s (0,60 mmol). Segu segati ligikaudu 15 minutit, seejärel reaktsioon peatati tiitrimisega 2% naatriumtiosulfaadi lahusega, kuni värvus kadus (~2 ml). Segu jahutati temperatuurini toatemperatuuril ja filtreeritakse. Segu puhastati preparatiivse kromatograafiaga C8 kolonnis (YMC, Inc., Wilmington, NC) atsetonitriili gradiendiga 0,1 M ammooniumatsetaadis, sooladest vabastati C8 YMC kolonnis atsetonitriili gradiendiga 0,25 N äädikhappes ja lüofiliseeritakse, et saada 350 mg sihtmärkpeptiidi 99% puhtusega.

Ülaltoodud kirjelduse põhjal saab vastava ala asjatundja hõlpsasti ära tunda käesoleva leiutise olulised tunnused ning ilma selle olemusest ja ulatusest kõrvale kaldumata teha leiutises mitmesuguseid muudatusi ja modifikatsioone, et kohandada seda erinevate rakenduste ja tingimustega. Seega on patendinõudlusega hõlmatud ka teised leiutise teostused.

NÕUE

1. Meetod peptiidi valemiga H-D--Nal--Thr-NH2 valmistamiseks, kusjuures nimetatud meetod sisaldab järgmisi etappe:

(a) esimese aminohappe kinnitamine tahke tugivaigu külge eetersidemega, et moodustada "esimene sidestusprodukt", mis hõlmab (i) tseesiumkarbonaadi vesilahuse reageerimist esimese aminohappe alkoholilahusega, et moodustada esimese aminohappe tseesiumisool, (ii) esimese aminohappe lahustivaba tseesiumisoola saamine, (iii) tahke tugivaigu reageerimine esimese aminohappe tseesiumisoolaga veevabas polaarses aprotoonses lahustis, moodustades "esimese lisamise toode",

kus esimene aminohape on Boc-L-Thr, mis vastab selle peptiidi C-terminaalsele aminohappele, ja tahke keskkonna vaik on klorometüleeritud polüstüreeni vaik;

(b) Boc kaitserühma eemaldamine esmalisatud produktilt happega, et moodustada "deprotekteeritud esmalisandprodukt";

(c) Valikuliselt lisades "deblokeeritud esimesele kinnitusproduktile" "järgmise aminohappe", mis hõlmab "järgmise aminohappe" reageerimist "deblokeeritud esimese kinnitusproduktiga" orgaanilises lahustis, mis sisaldab peptiidi kasvureaktiivi, et saada "blokeeritud järgmise aminohappe toode". lisamine" ja "järgmisel aminohappel" on peaahelas Boc poolt blokeeritud aminorühm ja kui sellel "järgmisel aminohappel" on kõrvalahelas üks või mitu funktsionaalrühma, siis külgahela funktsionaalrühmad ei vaja kaitset või nendel külgahela funktsionaalsetel rühmadel on kaitserühmad, mis on stabiilsed happeliste või leeliseliste kaitset eemaldavate ainete, vastavalt Boc ja Fmoc suhtes;

(d) Boc kaitse eemaldamine "blokeeritud järgmise toote" eest, mis hõlmab "blokeeritud järgmise produkti" reageerimist happega, et saada "deblokeeritud järgmine toode";

(e) valikuliselt sammude (c) ja (d) kordamine, kusjuures iga tsükkel annab "järgmise (X+1)-nda kinnituse deblokeeritud produkti", kus X on soovitud tsükli korduste arv;

(e) "järgmise aminohappe" lisamine etapis (b) saadud "deblokeeritud esimese lingi produktile" või valikuliselt etapi (e) "(X+1) järgmise lingi deblokeeritud produktile", mis hõlmab reaktsiooni "järgmine aminohape" läbiviimist täpsustatud "esimese kinnituse deblokeeritud produktiga" või "(X + 1) järgmise kinnituse deblokeeritud produktiga" orgaanilises lahustis, mis sisaldab peptiidi kasvatamiseks mõeldud reaktiivi. et saada "blokeeritud järgmine kinnitusprodukt" ja sellel "järgmisel aminohappel" on Fmoc-ga blokeeritud peaahela aminorühm, tingimusel et kui selle "järgmise aminohappe" kõrvalahelas on üks või mitu funktsionaalrühma, siis funktsionaalrühmad külgahelas ei vaja kaitset või külgahela funktsionaalrühmadel on kaitserühmad, mis on resistentsed leeliseliste reagentide suhtes, mida kasutatakse Fmoc kaitse eemaldamiseks;

(g) "blokeeritud järgmise produkti" Fmoc kaitse eemaldamine, mis hõlmab "blokeeritud järgmise produkti" reageerimist primaarse või sekundaarse amiiniga, et saada "deblokeeritud järgmine toode";

(h) valikuliselt korrates samme (e) ja (g), kusjuures iga tsükkel annab "järgmise (X+1)-nda kinnituse deblokeeritud korrutise", kus X on soovitud tsükli korduste arv, kuni need on lisatud tsüklisse. peptiid ja eelviimane aminohape vabaneb;

(i) N-otsa aminohappe lisamine "(X+1) järgmise liitumise deblokeeritud produktile", mis hõlmab N-terminaalse aminohappe reageerimist "järgmise (X+1) deblokeeritud produktiga" liitumine" orgaanilises lahustis, mis sisaldab reaktiivi peptiidi pikendamiseks, et moodustada "blokeeritud täielik kinnitusprodukt", kus "N-terminaalsel aminohappel" on Boc või Fmoc poolt blokeeritud aminorühm;

(j) Boc või Fmoc kaitse eemaldamine "blokeeritud valmistoote" eest, mis hõlmab "blokeeritud valmistoote" reageerimist happega Boc puhul või alusega Fmoc puhul, et moodustada vaigul valmis peptiid;

(j) kui "vaiguotsaga peptiidsaadusel" on külgahela funktsionaalrühmad, siis valikuliselt eemaldatakse "vaiguga lõppenud peptiidprodukti" kõrvalahela funktsionaalrühmade kaitse, mis hõlmab "vaiguga lõppenud peptiidsaaduse" reageerimist sobivate kaitset eemaldavate reagentidega. toota "täielikku peptiidprodukti kaitsmata vaigul"; Ja

(k) peptiidi eraldamine "vaigul valmis peptiidsaaduse" või "deprotekteeritud vaigul valmis peptiidsaaduse" tahkest vaigu kandja küljest peptiidi saamiseks, mis hõlmab "vaigul valmis peptiidsaaduse" või "vaigul valmis peptiidsaaduse" reageerimist. vaik"; deprotekteeritud vaik" ammoniaagi, primaarse amiini või sekundaarse amiiniga, kuni peptiidi lõhustamine vaigust on peaaegu täielik;

tingimusel, et peptiidi sünteesi etapid (e) ja (g) viiakse läbi kuus korda pärast valemiga H-L-Thr-vaigu "esimese kinnituse deblokeeritud produkti" moodustumist, kus järgnevad aminohapped on kinnitatud järjestus: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) ja Fmoc-L-Cys( Acm), moodustades H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-vaigu.

2. Meetod vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et ammoniaak, primaarne amiin või sekundaarne amiin etapis (k) on lahustis, mis sisaldab alkoholi ja valikuliselt aprotoonset polaarset lahustit.

3. Meetod vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et etapp (l) sisaldab veel järgmisi etappe:

(i) lõhustatud peptiidi sadestamist lahustist;

(ii) tahke vaigu kandja ja sadestunud peptiidi filtreerimine ja

(iii) peptiidi ekstraheerimine happelise lahusega peptiidi eraldamiseks.

4. Meetod vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 3, mis erineb selle poolest, et esimene aminohape on Boc-L-Thr tseesiumisool, mis annab esimese sidestusproduktina Boc-L-Thr vaigu ja "deblokeeritud esimene sidestusprodukt". " on H-L-Thr -vaik.

5. Meetod vastavalt punktile 4, mis erineb selle poolest, et etapis (i) Boc-kaitserühma eemaldamiseks kasutatav hape on trifluoroäädikhape (TFA).

6. Meetod vastavalt punktile 5, mis erineb selle poolest, et orgaaniline lahusti on metüleenkloriid, kloroform või dimetüülformamiid ja peptiidi kasvureagendiks on diisopropüülkarbodiimiid, ditsükloheksüülkarbodiimiid või N-etüül-N"-(3-dimetüülaminopropüül)karbodiimiid.

7. Meetod vastavalt nõudluspunktile 6, mis hõlmab Boc-D--Nal kinnitamist H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-vaiguga. vastavalt etapile (i), et saada Boc-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-vaiku.

8. Meetod vastavalt nõudluspunktile 7, mis hõlmab Boc-D-Nal-Cys(Acm)--st blokeeriva Boc-rühma, Tyr-i kaitsva O-t-Bu-rühma ja Lys-i kaitsva Boc-rühma samaaegset eemaldamist. Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-vaik, vastavalt etapile (d), et saada valmis peptiidprodukt vaigul valemiga H-D--Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-vaik.

9. Meetod vastavalt nõudluspunktile 8, mis hõlmab peptiidi H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr eraldamist tahkest vaigust, viies läbi reaktsiooni H-D-. -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-vaik ammoniaagiga lahustis, mis sisaldab alkoholi ja valikuliselt aprotoonset polaarset lahustit kuni praktiliselt täieliku eliminatsioonini, saades H-D--Nal -Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm)-Thr-NH2.

10. Meetod vastavalt nõudluspunktile 9, milles alkoholiks on metanool ja polaarseks aprotoonseks lahustiks on dimetüülformamiid.

11. Meetod vastavalt nõudluspunktile 10, mis hõlmab samaaegset Cys kaitsvate Acm rühmade eemaldamist ja saadud kaitsmata Cys jääkide tsükliseerimist "vaigul olevas täielikus peptiidsaaduses" valemiga H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D. -Trp- Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2, viies läbi H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH reaktsiooni 2 joodi lahusega alkoholis, et sisuliselt lõpetada kaitserühma eemaldamine ja tsükliseerimine, et saada H-D--Nal--Thr-NH2.