Sinteza čvrste faze. Struktura peptida. Reakcije stvaranja peptidne veze
Kombinatorna sinteza može se provesti ne samo u otopini (sinteza u tekućoj fazi), već i na površini čvrste kemijski inertne faze. U tom slučaju se prvi polazni materijal kemijski "prišije" na funkcionalne skupine na površini polimernog nosača (najčešće se koristi esterska ili amidna veza) i tretira otopinom drugog polaznog materijala koji se uzima u značajan višak tako da reakcija ide do kraja. Postoji određena pogodnost u ovom obliku reakcije, jer je tehnika izolacije proizvoda olakšana: polimer (obično u obliku granula) se jednostavno odfiltrira, temeljito ispere od ostataka drugog reagensa, a ciljni spoj se kemijski odcijepljen od njega.
U organskoj kemiji ne postoji niti jedna reakcija koja u praksi daje kvantitativne prinose ciljnih proizvoda u bilo kojem slučaju. Čini se da je jedina iznimka potpuno izgaranje organskih tvari u kisiku pri visoka temperatura na CO 2 i H 2 O. Stoga je pročišćavanje ciljnog produkta uvijek neizostavan, a često i najteži i najdugotrajniji zadatak. Posebno težak zadatak je izolacija produkata sinteze peptida, na primjer, odvajanje složene smjese polipeptida. Stoga je u sintezi peptida metoda sinteze na čvrstom polimernom supstratu, koju je ranih 1960-ih razvio R.B. Merifield, postala najšire korištena.
Polimerni nosač u Merrifield metodi je granulirani umreženi polistiren koji sadrži klorometilne skupine u benzenskim prstenovima, koji su poveznici koji vežu potporu za prvi aminokiselinski ostatak polipeptida. Ove skupine pretvaraju polimer u funkcionalni analog benzil klorida i daju mu sposobnost lakog stvaranja esterskih veza nakon reakcije s karboksilatnim anionima. Kondenzacija takve smole s N-zaštićenim aminokiselinama dovodi do stvaranja odgovarajućih benzil estera. Uklanjanje N-zaštite daje C-zaštićeni derivat prve aminokiseline kovalentno vezane na polimer. Aminoacilacija oslobođene amino skupine s N-zaštićenim derivatom druge aminokiseline, nakon čega slijedi uklanjanje N-zaštite, rezultira sličnim dipeptidnim derivatom također vezanim za polimer:
Takav dvostupanjski ciklus (deprotekcija - aminoacilacija) može se, u načelu, ponoviti onoliko puta koliko je potrebno za izgradnju polipeptidnog lanca zadane duljine.
Daljnji razvoj Merifieldovih ideja bio je usmjeren prvenstveno na pronalaženje i stvaranje novih polimerni materijali za supstrate, razvoj metoda za odvajanje produkata i stvaranje automatiziranih postrojenja za cijeli ciklus sinteze polipeptida
Učinkovitost Merifieldove metode dokazana je uspješnom sintezom niza prirodnih polipeptida, posebice inzulina. Osobito jasno su se njegove prednosti pokazale na primjeru sinteze enzima ribonukleaze. Tako je, primjerice, uz poprilične napore, tijekom nekoliko godina, Hirschman i 22 zaposlenika izveli sintezu enzima ribonukleaze (124 aminokiselinska ostatka) tradicionalnim metodama tekuće faze. Gotovo istodobno, isti je protein dobiven automatiziranom sintezom čvrste faze. U drugom slučaju, sinteza, koja uključuje ukupno 11.931 različitih operacija, uključujući 369 kemijske reakcije, završilo je dvoje sudionika (Gatte i Merrifield) u samo nekoliko mjeseci.
Merrifieldove ideje poslužile su kao osnova za stvaranje razne metode kombinatorna sinteza biblioteka polipeptida različitih struktura.
Tako je 1982. godine predložena originalna strategija za višestupanjsku paralelnu sintezu peptida na čvrstoj fazi, poznata kao "split metoda" ( podjela- cijepanje, razdvajanje) ili metodom “pomiješaj i podijeli” (slika 3). Njegova suština je sljedeća. Recimo da od tri aminokiseline (A, B i C) treba dobiti sve moguće kombinacije tripeptida. Da bi se to postiglo, granule krutog polimernog nosača (P) se dijele na tri jednaka dijela i tretiraju otopinom jedne od aminokiselina. U ovom su slučaju sve aminokiseline kemijski vezane na površinu polimera pomoću jedne od svojih funkcionalnih skupina. Dobiveni polimeri triju razreda temeljito se izmiješaju, a smjesa se ponovno podijeli na tri dijela. Zatim se svaki dio, koji sadrži sve tri aminokiseline u jednakim količinama, ponovno tretira s jednom od iste tri aminokiseline i dobije se devet dipeptida (tri mješavine od po tri proizvoda). Drugim miješanjem, dijeljenjem na tri jednaka dijela i tretiranjem aminokiselinama dobiva se željenih 27 tripeptida (tri mješavine po devet proizvoda) u samo devet faza, dok bi njihovo odvojeno dobivanje zahtijevalo sintezu od 27 × 3 = 81 faza.
Čvrstofazna sinteza ili tehnologija čvrste faze, koja se često naziva i keramička, najzastupljenija je u proizvodnji anorganskih materijala za razne grane znanosti i industrije. Tu spadaju nuklearno gorivo, materijali za svemirsku tehnologiju, radioelektronika, instrumentacija, katalizatori, vatrostalni materijali, visokotemperaturni supravodiči, poluvodiči, fero- i piezoelektrici, magneti, razni kompoziti i mnogi drugi.
Sinteza u čvrstoj fazi temelji se na kemijskim reakcijama u kojima je barem jedan od reaktanata u obliku krutine. Takve reakcije se nazivaju heterogene ili čvrste faze. Interakcija u čvrstoj fazi, za razliku od reakcija u tekućem ili plinovitom mediju, sastoji se od dva temeljna procesa: od same kemijske reakcije i prijenosa tvari u reakcijsku zonu.
Reakcije u čvrstom stanju koje uključuju kristalne komponente karakterizirane su ograničenom pokretljivošću njihovih atoma ili iona i složenom ovisnošću o mnogim čimbenicima. To uključuje kemijsku strukturu i pridruženu reaktivnost krutina koje reagiraju, prirodu i koncentraciju nedostataka, stanje površine i morfologiju reakcijske zone, kontaktno područje reagensa u interakciji, preliminarnu mehanokemijsku aktivaciju i brojne drugi. Sve navedeno određuje složenost mehanizama heterogenih reakcija. Proučavanje heterogenih reakcija temelji se na kemiji čvrstog stanja, kemijskoj fizici i fizikalnoj kemiji površine čvrstih tijela, na zakonima termodinamike i kinetike.
Često se mehanizam reakcija čvrstog stanja prosuđuje samo na temelju toga što se eksperimentalni podaci o stupnju interakcije kao funkciji vremena najbolje opisuju bilo kojim specifičnim kinetičkim modelom i odgovarajućom kinetičkom jednadžbom. Ovakav pristup može dovesti do netočnih zaključaka.
Procesi u materijalima u čvrstom stanju imaju niz važnih razlika od procesa u tekućinama ili plinovima. Ove razlike povezane su, prije svega, sa značajno (za nekoliko redova veličine) nižom brzinom difuzije u čvrstim tijelima, što sprječava usrednjavanje koncentracije komponenti u sustavu i, stoga, dovodi do prostorne lokalizacije procesa koji se odvijaju. Prostorna lokalizacija, pak, dovodi do činjenice da i specifična brzina procesa (ili koeficijent difuzije) i geometrija reakcijske zone doprinose promatranoj kinetici procesa. Takve značajke procesa u čvrstoj fazi određene geometrijskim faktorima nazivaju se topokemijskim. Nadalje, budući da su transformacije o kojima se raspravlja prostorno lokalizirane, njihova se brzina može odrediti i samim procesima na granici faza (reakcijska kontrola) i brzinom dovoda bilo koje komponente u ovo sučelje ili uklanjanja proizvoda ( s) (kontrola difuzije). Ovi slučajevi za jednostavne sustave, za koje su zadovoljene pretpostavke modela, mogu se eksperimentalno identificirati oblikom vremenske ovisnosti stupnja pretvorbe. Druga značajka faznih transformacija u čvrstim tijelima povezana je s činjenicom da stvaranje nove fazne jezgre u čvrstoj matrici uzrokuje pojavu elastičnih naprezanja u potonjoj, čija se energija u nekim slučajevima mora uzeti u obzir pri razmatranju termodinamike. ovih transformacija.
Velik broj čimbenika koji utječu na kinetiku procesa u čvrstoj fazi i mikrostrukturu tako dobivenih materijala uvjetuje i višestrukost tipova klasifikacije ovih procesa. Dakle, razmatrajući stabilnost sustava u odnosu na fluktuacije različitih vrsta, heterogene (u slučaju sustava koji su stabilni na male fluktuacije u zauzetom volumenu i nestabilne na velike) i homogene (u slučaju sustava koji su nestabilni do malih kolebanja) razlikuju se procesi. Za heterogene procese, kao primjer, mogu se navesti transformacije koje se odvijaju prema mehanizmu nastanka i rasta jezgri, za homogene procese, neki prijelazi reda i nereda i spinodalna dekompozicija krutih otopina.
Kod heterogenih procesa potrebno je razlikovati heterogenu i homogenu nukleaciju od heterogenih i homogenih procesa. Heterogena nukleacija odnosi se na stvaranje jezgri na strukturnim defektima (uključujući točkaste defekte, dislokacije i fazne granice); homogena nukleacija – stvaranje jezgri u volumenu čvrste faze bez defekata.
Analizirajući produkt transformacije čvrste faze, razlikuju se jednofazne i višefazne jezgre. U slučaju višefaznih jezgri produkt procesa je višefazna kolonija karakteristične mikrostrukture određene površinskom energijom granice nastalih faza; procesi ovog tipa nazivaju se diskontinuirani, za razliku od kontinuiranih procesa u slučaju stvaranja i rasta jednofaznih jezgri.
Drugi način klasifikacije transformacija čvrste faze temelji se na usporedbi sastava početne faze i sastava produkta reakcije. Ako se poklapaju, govore o bezdifuzijskim procesima, a ako se mijenja sastav, govore o difuziji. Štoviše, korisno je razlikovati od nedifuzijskih procesa kooperativne procese (na primjer, martenzitnu transformaciju) koji se javljaju uz pomoć istovremenog laganog pomicanja atoma u velikom volumenu početne faze.
Bezdifuzijske fazne transformacije mogu se razlikovati po vrsti termodinamičkih karakteristika koje se mijenjaju tijekom procesa.
Transformacije prve vrste su procesi u kojima dolazi do promjene izvoda kemijskog potencijala u odnosu na temperaturu ili tlak. To implicira naglu promjenu tijekom faznog prijelaza takvih termodinamičkih parametara kao što su entropija, volumen, entalpija i unutarnja energija. Pri transformacijama druge vrste ne mijenjaju se prve derivacije kemijskog potencijala u odnosu na intenzivne parametre, ali se mijenjaju derivacije viših redova (počevši od drugog). U tim procesima, uz kontinuiranu entropiju i volumen sustava, dolazi do nagle promjene veličina izraženih drugim derivatima Gibbsove energije: toplinski kapacitet, koeficijent toplinskog rastezanja, stlačivost itd.
Reakcije čvrste faze između dviju faza (kontakti između tri ili više faza su malo vjerojatni, a odgovarajući procesi mogu se prikazati kao kombinacije nekoliko dvofaznih reakcija) su difuzijski procesi i mogu biti heterogeni ili homogeni, s heterogenom i homogenom nukleacijom . Homogeni procesi i procesi s homogenom nukleacijom u takvim reakcijama mogući su, primjerice, u slučaju stvaranja metastabilne čvrste otopine s njezinom naknadnom razgradnjom (tzv. unutarnje reakcije). Primjer takvih procesa može biti unutarnja oksidacija.
Uvjet za termodinamičku ravnotežu u pretvorbi čvrstog stanja, kao iu svakoj drugoj kemijskoj pretvorbi, je jednakost kemijskih potencijala komponenata u polaznim tvarima i produktima reakcije. U međudjelovanju dviju čvrstih faza može se ostvariti navedena jednakost kemijskih potencijala različiti putevi: 1) preraspodjela komponenata u početnim fazama s nastankom čvrstih otopina; 2) stvaranje novih faza s drugačijom kristalnom strukturom (što se, zapravo, obično naziva reakcija čvrste faze), a budući da kemijski potencijal komponente u različitim fazama višefaznog sustava ne ovisi o količini svakoj fazi, ravnoteža se može postići samo kada potpuna transformacija početne faze. Najpouzdanije informacije o mehanizmu reakcija čvrste faze dobivaju se kompleksnom primjenom, koja omogućuje istovremeno promatranje nekoliko parametara reagirajućeg sustava, uključujući fazni sastav, toplinske učinke, promjene mase i drugo.
Termodinamičku teoriju reakcija u čvrstom stanju predložio je Wagner, a dalje razvio Schmalzried na primjeru adicijskih reakcija.
Do danas ne postoji jedinstvena klasifikacija širokog spektra heterogenih reakcija. To je zbog poteškoća u odabiru kriterija kao temelja za takvu univerzalnu klasifikaciju. Prema kemijskim kriterijima, reakcije se dijele na reakcije oksidacije, redukcije, razgradnje, spajanja, izmjene itd. Uz navedeni kriterij široko se koristi kao glavni kriterij za fizičko stanje reagensa:
Karakteristična značajka svih heterogenih reakcija je postojanje i lokalizacija na faznoj granici reakcijske zone. Reakcijska zona, u pravilu, male debljine odvaja dva područja prostora koja zauzimaju tvari različitog sastava i s razna svojstva. Razlozi za nastanak reakcijske zone obično se dijele u dvije skupine: relativna sporost difuzijskih procesa i kemijski razlozi. Posljednja skupina je zbog visoke reaktivnosti atoma ili molekula smještenih na površini krutog reagensa ili na sučelju između dvije postojeće faze. Poznato je da površina krute ili tekuće tvari ima svojstva koja se razlikuju od svojstava mase kompaktnog uzorka. To čini svojstva sučelja specifičnima. Ovdje se događa značajno preuređenje kristalnog pakiranja, smanjuju se naprezanja između dviju kristalnih rešetki i mijenja se kemijski sastav.
Budući da se prijenos mase odvija difuzijom, a difuzijska pokretljivost krutih čestica ovisi o defektnosti njihove strukture, može se očekivati značajan utjecaj defekata na mehanizam i kinetiku reakcija čvrste faze. Ova faza prethodi kemijskoj fazi transformacije reaktanata na međufaznoj površini. Dakle, kinetika heterogenih reakcija određena je i prirodom tijeka same kemijske reakcije i metodom isporuke tvari u reakcijsku zonu. Sukladno gore navedenom, brzina reakcije bit će ograničena kemijskim stupnjem (kemijska kinetika) ili difuzijom (kinetika difuzije). Takav se fenomen opaža u stvarnosti.
Prema Wagneru, difuzija i, posljedično, reakcija u čvrstim tijelima odvija se uglavnom zbog pokretljivosti iona i elektrona, zbog neravnotežnog stanja rešetke. Različiti ioni rešetke kreću se u njoj različitim brzinama. Posebno je pokretljivost aniona u velikoj većini slučajeva zanemariva u usporedbi s pokretljivošću kationa. Stoga se difuzija i, sukladno tome, reakcija u čvrstim tvarima provodi zbog kretanja kationa. U tom slučaju, difuzija različitih kationa može ići u istom smjeru ili jedan prema drugom. Kod različito nabijenih kationa očuvana je elektroneutralnost sustava zahvaljujući gibanju elektrona. Zbog razlike u brzinama gibanja različito nabijenih kationa u sustavu se javlja električni potencijal. Kao rezultat toga, brzina kretanja pokretnijih iona opada i, obrnuto, za manje pokretljive? povećava se. Dakle, rezultirajući električni potencijal regulira stopu difuzije iona. Potonji i njime određena brzina cjelokupnog procesa transformacije čvrstog stanja može se izračunati na temelju elektronske vodljivosti i prijenosnih brojeva. Očito je da je usmjerena difuzija iona moguća samo u električno polje ili ako u sustavu postoji koncentracijski gradijent.
U sintezi tvari u čvrstom stanju često je potrebno kontrolirati ne samo kemijski (elementarni i fazni) sastav dobivenog produkta, već i njegovu mikrostrukturnu organizaciju. To je zbog snažne ovisnosti kemijskih (na primjer, aktivnost u reakcijama čvrste faze) i mnogih fizikalnih (magnetskih, električnih, optičkih itd.) svojstava o karakteristikama strukturne organizacije krutine na različitim hijerarhijskim razinama. Prva od tih razina uključuje elementarni sastav krutine i način međusobnog rasporeda atoma elemenata u prostoru - kristalnu strukturu (ili značajke najbližeg koordinacijskog okruženja atoma u amorfnim krutinama), kao i sastav i koncentracija točkastih defekata. Kao sljedeću razinu strukture čvrstog tijela možemo smatrati raspodjelu proširenih defekata u kristalu, koja određuje veličine područja u kojima se (korigirano za postojanje točkastih defekata) uočava translacijska simetrija u rasporedu atoma. . Takva se područja mogu smatrati savršenim mikrokristalima i nazivaju se područjima koherentnog raspršenja. Govoreći o područjima koherentnog raspršenja, mora se imati na umu da, u općem slučaju, oni nisu ekvivalentni kompaktnim česticama koje tvore materijal čvrste faze, koji može sadržavati značajan broj proširenih defekata, i, posljedično, područja koherentnog raspršenja. raspršivanje. Podudarnost područja koherentnog raspršenja s česticama (koje se u ovom slučaju nazivaju jednodomenskim) obično se opaža samo za dovoljno male (manje od 100 nm) veličine potonjih. Naknadne strukturne razine mogu se povezati s oblikom i raspodjelom veličine čestica koje tvore prah ili keramički materijal, njihovom agregacijom, agregacijom primarnih agregata itd.
Različite primjene materijala čvrste faze imaju različite, često proturječne, zahtjeve za strukturne karakteristike navedene gore i stoga zahtijevaju različite sintetske metode. Stoga je ispravnije govoriti o metodama sinteze ne tvari krute faze, već materijala krute faze i, u svakom slučaju, odabrati metodu sinteze uzimajući u obzir područje naknadne primjene dobivenog proizvoda.
U općem slučaju, metode za sintezu čvrstih materijala mogu se klasificirati prema njihovoj udaljenosti od termodinamički ravnotežnih uvjeta za tijek korištenih kemijskih procesa. U skladu s općim zakonima, pod uvjetima koji odgovaraju stanju što je moguće dalje od ravnoteže, opaža se značajan višak brzine nukleacije nad brzinom rasta formiranih jezgri, što očito dovodi do dobivanja najraspršenijeg proizvoda. U slučaju provođenja procesa blizu termodinamičke ravnoteže, rast već formiranih jezgri događa se brže od stvaranja novih, što zauzvrat omogućuje dobivanje grubozrnatih (u graničnom slučaju monokristalnih) materijala. Brzina rasta kristala također je uvelike određena koncentracijom proširenih (neravnotežnih) defekata u njima.
Sinteza u čvrstoj fazi temelji se na činjenici da je prva karika budućeg oligomera kovalentno vezana za "sidrenu" skupinu H. Produženje lanca se provodi standardnim zaštićenim monomerima prema uobičajenim shemama koje se koriste za sintezu u otopinama. Zaključiti. faza sinteze. oligomer se odcijepi od N. i pročisti odgovarajućim metodama. Uglavnom se koristi sinteza čvrste faze. za dobivanje polipeptida, oligonukleotida i oligosaharida.
Tijekom sinteze polipeptida kao N. naib. naširoko se koristi kopolimer stirena i 1-2% divinilbenzena, modificiran uvođenjem dimetoksibenzil kloridne sidrene skupine za spajanje prve aminokiseline (sa zaštićenom N H 2 skupinom) na C-kraju, na primjer:
Nakon uklanjanja N-zaštitne skupine, produljenje polipeptidnog lanca provodi se standardnim metodama sinteze peptida u otopini (vidi Peptidi). Kao sredstva za kondenzaciju, Naib. često se koriste karbodiimidi ili se aminokiseline prethodno pretvore u aktivator. eteri.
U sintezi oligonukleotida kao nukleinske kiseline koriste se makroporozna stakla ili silikagel. Sidrena skupina je karboksilna skupina, odvojena od N. spec. "noga", na primjer:
B-purinska ili pirimidna baza
U prvoj fazi, nukleozid je vezan za nosač na 3 "-hidroksilnoj skupini deoksiriboze, u kojoj je hidroksilna skupina na položaju 5" zaštićena dimetoksitritilnom skupinom (CH 3 OS 6 H 4) 2 (C 6 H 5) C (DMTr); količina potonjeg nakon njegovog odvajanja lako se mjeri spektrofotometrijski, što služi kao količina. karakterističan za punjenje nosača i omogućuje procjenu prinosa u sljedećim fazama izgradnje oligonukleotidnog lanca. Nakon uklanjanja DMTr skupine, lanac se sastavlja pomoću fosfitamida (fl. I; M. Kaposers, 1980.) ili fosfonata (hidrofosfonati) (II; R. Stremberg, 1986.):
Za provedbu sinteze čvrste faze potrebni su visoki prinosi (na razini 96-99%) u svakoj fazi distrikta, kao i učinkovite metode pročišćavanje i izolacija sintetiziranih. veze.
Korištenje krute faze omogućuje značajno pojednostavljenje i ubrzavanje svake faze lančanog rasta oligomera, budući da se odvajanje suvišnih komponenti, kondenzacijskih sredstava i nusproizvoda u otopini postiže filtriranjem reakcija. smjese i pranje N. odgovarajućim skupom otopina. Stoga se proces sastavljanja oligomernog lanca rastavlja na niz standardnih operacija: deblokiranje rastućeg kraja lanca, doziranje sljedećeg zaštićenog monomera i kondenzacijskog sredstva, dovođenje ove smjese u N. kolonu tijekom izračunatog vremena i pranje izbacite N. odgovarajućim otapalom. Ciklus izgradnje monomerne veze m. b. automatizirano.
U srcu automatike maturalna večer. synths je uobičajen kružni dijagram(vidi sliku). Brojni modeli sintetizatora razlikuju se po dizajnu kolona i njihovom broju, načinu dovoda reagensa i otapala itd. Upravljanje i programiranje provodi se pomoću ugrađenog ili udaljenog računala.
Shematski dijagram automatskog uređaja. maturalna večer. sintesajzeri (električni upravljački vod označen je isprekidanom linijom): 1 - dovodni vod monomera (M 1 , M n) i kondenzacijskog sredstva (KA); 2-linija za dovod reagensa (npr. oksidansa, acilatora, to-t, itd.) i p-otapala (P 1 , P n); 3 - preklopni ventili; 4 stupca s medijima, opremljena distribucijom. ventil; 5-fotometrijski ćelija; 6-metarski; 7-upravljačka i programska jedinica; 8-zaslon.
Potencijal sinteze u čvrstoj fazi dokazan je sintezom ribonukleaze A (R. Merrifield, 1969.) i ljudskog hormona rasta (D. Yamashiro, 1970.), dugih 124 odnosno 183 aminokiseline. Međutim, zbog male, ali stalne racemizacije koja se događa tijekom stvaranja peptidne veze, sintetizator. proteini imaju nisku biol. aktivnost, dakle automatski. sintesajzere koriste Ch. arr. za dobivanje kratkih polipeptida (10-30 veza), uključujući i preparativne
Izum se odnosi na metodu čvrste faze za sintezu peptida formule H-D--Nal--Thr-NH2, koja koristi i Boc-zaštićene i Fmoc-zaštićene aminokiseline i klormetiliranu polistirensku smolu. 10 z.p. letjeti.
Područje tehnike kojem izum pripada
Predmetni izum se odnosi na postupak za pripremu peptida koji sadrži tri ili više aminokiselinskih ostataka, koji ima N-terminalnu aminokiselinu, pretposljednju aminokiselinu koja je susjedna N-terminalnoj aminokiselini i C-terminalnu aminokiselinu.
Prethodna umjetnost
Sinteza peptida u čvrstoj fazi uvedena je 1963. kako bi se prevladali mnogi problemi srednjih koraka pročišćavanja povezanih sa sintezom peptida u otopini (Stewart et. al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2. izdanje, 1984.). U sintezi na čvrstoj fazi, aminokiseline se sastavljaju (npr. spajaju) u peptid u bilo kojem željenom slijedu, dok je jedan kraj lanca (npr. C-terminus) vezan za netopljivi nosač. Nakon što je željena sekvenca sastavljena na nosaču (nosač), peptid se tada otpušta (tj. cijepa) s nosača. Dvije standardne zaštitne skupine za α-amino skupine aminokiselina koje treba povezati su Boc, koja se uklanja jakom kiselinom, i Fmoc, koja se uklanja bazom. Predmetni izum odnosi se na prikladnu metodu za proizvodnju peptida korištenjem kombinacije obje ove zaštite za a-amino skupine u jednoj sintezi na jeftinoj smoli od klormetiliranog polistirena.
Pri projektiranju sinteze peptida čvrste faze korištenjem bilo koje od gornjih shema zaštite α-amino, važno je da sve reaktivne "bočne skupine" aminokiselina koje čine peptid budu zaštićene od neželjenih kemijskih reakcija tijekom sklapanja lanca. Također je poželjno da kemijske skupine odabrane za zaštitu različitih bočnih skupina ne budu uklonjene reagensima koji se koriste za uklanjanje zaštite s P-amino skupina. Treće, važno je da je veza rastućeg peptidnog lanca s česticom smole otporna na reagense koji se koriste u procesu sastavljanja lanca za uklanjanje bilo koje vrste α-amino zaštite. U slučaju sheme zaštite α-amino koja koristi Fmoc, zaštita bočne skupine mora biti otporna na alkalne reagense koji se koriste za uklanjanje Fmoc. U praksi, ove zaštitne skupine bočnog lanca obično se uklanjaju s blago kiselim reagensima nakon što se završi sastavljanje peptidnog lanca. Ako se koristi shema zaštite β-amino skupine koja koristi Boc, zaštita bočne skupine mora biti otporna na slabo kiseli reagens koji se koristi za uklanjanje Boc skupine u svakom ciklusu. U praksi, ove zaštitne skupine bočnog lanca u β-amino zaštitnoj shemi s Boc obično se uklanjaju s bezvodnim HF nakon dovršetka sklapanja peptidnog lanca. Stoga, u praksi, uobičajeno korištene zaštitne skupine bočnog lanca u α-amino zaštitnoj shemi s Fmoc nisu stabilne u uvjetima koji se koriste za uklanjanje zaštite α-amino skupina s Boc. Stoga se dvije vrste zaštitnih shema za α-amino skupine ne kombiniraju tijekom sastavljanja peptidnog lanca u sintezi peptida u čvrstoj fazi. Osim toga, iako se najjeftinija polimerna smola koja se koristi u sintezi peptida (klormetilirani polistiren ili "Maryfield smola") široko koristi zajedno s aminokiselinama zaštićenim Boc skupinama, u literaturi je zaključeno da nije primjenjiva u slučaju zaštite α-amino skupina s Fmoc skupinama zbog svoje nestabilnosti u alkalnim uvjetima (vidi Stewart et. al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2. izdanje, 1984.). Ovaj izum je usmjeren na metodu za ko-upotrebu određenih peptida u sintezi čvrste faze Boc-zaštićenih i Fmoc-zaštićenih aminokiselina na Merifield smoli.
Poznato je da Lanreotide®, koji je analog somatostatina, inhibira oslobađanje hormona rasta i također inhibira inzulin, glukagon i egzokrinu sekreciju gušterače.
US patent br. 4,853,371 otkriva i zahtijeva Lanreotide®, postupak za njegovu pripremu i metodu za inhibiciju izlučivanja hormona rasta, inzulina, glukagona i egzokrinog izlučivanja pankreasa.
US patent br. 5147856 otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje restenoze.
US patent br. 5411943 otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje hepatoma.
US patent br. 5073541 otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje raka pluća.
US patentna prijava br. 08/089410, podnesena 9. srpnja 1993., otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje melanoma.
US patent broj 5,504,069 otkriva upotrebu Lanreotida® za inhibiciju ubrzanog rasta solidnog tumora.
US patentna prijava br. 08/854941, podnesena 13. svibnja 1997., otkriva upotrebu Lanreotida® za mršavljenje.
US patentna prijava br. 08/854,943, podnesena 13. svibnja 1997., otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje inzulinske rezistencije i sindroma X.
US patent br. 5688418 otkriva upotrebu Lanreotida® za produljenje održivosti stanica gušterače.
PCT prijava br. PCT/US 97/14154 otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje fibroze.
US patentna prijava br. 08/855311, podnesena 13. svibnja 1997., otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje hiperlipidemije.
US patentna prijava br. 08/440061, podnesena 12. svibnja 1995., otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje hiperamilinemije.
US patentna prijava br. 08/852221, podnesena 7. svibnja 1997., otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje hiperprolaktinemije i prolaktinoma.
Suština izuma
Predmetni izum osigurava metodu za pripremu peptida koji sadrži tri ili više aminokiselinskih ostataka, koji ima N-terminalnu aminokiselinu, pretposljednju aminokiselinu koja je susjedna N-terminalnoj aminokiselini i C-terminalnu aminokiselinu, navedena metoda uključuje sljedeće korake:
(a) spajanje prve aminokiseline na krutu potpornu smolu eterskom vezom kako bi se formirao prvi produkt spajanja, što uključuje (i) reakciju vodene otopine cezijevog karbonata s alkoholnom otopinom prve aminokiseline kako bi nastala cezijeva sol prve aminokiseline, (ii) dobivanje cezijeve soli prve aminokiseline bez otapala, (iii) reakciju čvrste potporne smole s cezijevom soli prve aminokiseline u suhom (bezvodnom) polarnom aprotonskom otapalu da se dobije prvi dodatni proizvod,
gdje prva aminokiselina odgovara C-terminalnoj aminokiselini peptida, amino skupina nepostranog (glavnog) lanca prve aminokiseline blokira Boc, a prva aminokiselina nema funkcionalnu skupinu u bočnom lancu koji zahtijeva zaštitu, a čvrsti nosač - smola - je smola klorometiliranog polistirena;
(b) uklanjanje zaštite (deblokiranje) Boc iz proizvoda prvog pristupa s kiselinom da se dobije deblokirani produkt prvog pristupa;
(c) izborno, pričvršćivanje sljedeće aminokiseline na deblokirani prvi produkt pričvršćivanja, što uključuje reakciju sljedeće aminokiseline s deblokiranim prvim produktom pričvršćivanja u organskom otapalu koje sadrži reagens za rast peptida kako bi se dobio blokirani (zaštićeni) sljedeći produkt pričvršćivanja, pri čemu sljedeća aminokiselina u glavnom lancu ima amino skupinu blokiranu s Boc, a ako sljedeća aminokiselina ima jednu ili više funkcionalnih skupina u bočnom lancu, tada funkcionalne skupine u bočnom lancu ne zahtijevaju zaštitu ili funkcionalne skupine u bočnom lancu imaju zaštitne skupine koje su otporne na kisele ili alkalne reagense koji se koriste za uklanjanje zaštite, Boc i Fmoc;
(d) uklanjanje Boc zaštite od blokiranog sljedećeg adukta, što uključuje reakciju blokiranog sljedećeg adukta s kiselinom kako bi se dobio deprotektirani sljedeći adukt;
(e) po izboru, ponavljanje koraka (c) i (d), sa svakim ciklusom koji generira otpušteni produkt (X+1) sljedećeg vezanja, gdje je X broj potrebnog ponavljanja ciklusa;
(f) dodavanje sljedeće aminokiseline otpuštenom prvom proizvodu vezivanja iz koraka (b) ili, izborno, oslobođenom (X+1) sljedećem proizvodu vezivanja iz koraka (e), što uključuje reakciju sljedeće aminokiseline s navedenim prvi produkt pričvršćivanja ili s navedenim deblokiranim produktom (X+1) sljedećeg pričvršćivanja u organskom otapalu koje sadrži reagens za rast peptida da bi se dobio blokirani (zaštićeni) produkt sljedećeg pričvršćivanja, a sljedeća aminokiselina ima glavni lanac amino skupina blokirana s Fmoc, pod uvjetom da ako sljedeća aminokiselina ima jednu ili više funkcionalnih skupina u bočnom lancu, tada funkcionalne skupine u bočnom lancu ne zahtijevaju zaštitu ili funkcionalne skupine u bočnom lancu imaju zaštitne skupine koje su otporan na alkalne reagense koji se koriste za deprotekciju Fmoc;
(g) uklanjanje zaštite Fmoc od blokiranog sljedećeg adukta, što uključuje reakciju blokiranog sljedećeg adukta s primarnim ili sekundarnim aminom da se dobije deprotektirani sljedeći adukt;
(h) izborno, ponavljanje koraka (e) i (g), pri čemu svaki ciklus generira deblokirani proizvod (X+1) sljedećeg dodavanja, gdje je X broj potrebnog ponavljanja ciklusa, do pretposljednjeg uključena je u peptid i deblokirana aminokiselina;
(i) pričvršćivanje N-terminalne aminokiseline na deprotektirani (X+1) sljedeći pristupni produkt, što uključuje reakciju N-terminalne aminokiseline s deprotektiranim (X+1) sljedećim pristupnim proizvodom u organskom otapalu koje sadrži reagens za rast peptida, da se dobije blokirani krajnji produkt, gdje N-terminalna aminokiselina ima okosnicu amino skupine blokiranu s Boc ili Fmoc;
(j) deprotekciju Boc ili Fmoc s blokiranog kompletnog adicijskog produkta, što uključuje reakciju blokiranog kompletnog adicijskog produkta s kiselinom u slučaju Boc ili bazom u slučaju Fmoc da se formira kompletan peptidni produkt na smoli;
(j) ako dovršeni peptidni produkt na smoli ima funkcionalne skupine bočnog lanca, tada izborno uklanjanje zaštite funkcionalnih skupina bočnog lanca dovršenog peptidnog produkta na smoli, što uključuje reakciju dovršenog peptidnog produkta na smoli s prikladnim reagensima za uklanjanje zaštite da se dobije dovršeni peptidni proizvod na smoli uklonjena zaštita; I
(k) cijepanje peptida od čvrstog smolnog nosača dovršenog peptidnog produkta na smoli ili dovršenog peptidnog produkta na deprotektiranoj smoli da bi se dobio peptid, što uključuje reakciju dovršenog peptidnog produkta na smoli ili dovršenog peptidnog produkta na deprotektiranoj smoli s amonijakom primarni amin ili sekundarni amin do praktičnog završetka cijepanja peptida od smole;
uz uvjet da se koraci (e) i (g) u sintezi peptida moraju izvesti najmanje jednom.
Poželjan je postupak prema ovom izumu gdje je amonijak, primarni amin ili sekundarni amin u koraku (k) u otapalu koje sadrži alkohol i izborno aprotonsko polarno otapalo,
Poželjna je metoda prema ovom izumu, gdje korak (l) nadalje sadrži sljedeće korake:
taloženje odcijepljenog peptida iz otapala;
odvajanje filtracijom čvrstog smolastog nosača i istaloženog peptida, i
ekstrahiranje peptida kiselom otopinom da se izolira peptid.
Poželjna je metoda prema ovom izumu, gdje je prva aminokiselina Boc-L-Thr.
Poželjna je metoda u skladu s ovim izumom, gdje je prva aminokiselina cezijeva sol Boc-L-Thr, čime se dobiva Boc-L-Thr smola kao prvi produkt spajanja, a deblokirani prvi produkt spajanja je smola H-L-Thr .
Poželjan je postupak prema ovom izumu gdje je kiselina korištena za uklanjanje Boc zaštitne skupine u koraku(ima) trifluoroctena kiselina (TFA).
Poželjna metoda, povezana s neposredno prethodnim postupkom, je kada je organsko otapalo metilen klorid, kloroform ili dimetilformamid, a reagens za rast peptida je diizopropilkarbodiimid, dicikloheksilkarbodiimid ili N-etil-N"-(3-dimetil-aminopropil)karbodiimid .
Poželjna metoda, povezana s neposredno prethodnom metodom, je metoda koja se sastoji od izvođenja koraka (e) i (g) šest puta nakon formiranja deblokiranog produkta prvog vezivanja formule H-L-Thr-smole, gdje slijedeći amino kiseline su vezane redom: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) i Fmoc- L-Cys(Acm) da se dobije produkt H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-smola.
Poželjna metoda, koja se odnosi na neposredno prethodnu metodu, je metoda koja uključuje dodavanje Boc-D-Nal u H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val- Cys(Acm) -Tnr-smola prema koraku (c) da se dobije Boc-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Ast) -Thr-smola.
Poželjna metoda, povezana s neposredno prethodnom metodom, uključuje istovremeno uklanjanje Boc skupine koja štiti D-Nal, O-t-Bu skupine koja štiti Tyr i Boc skupine koja štiti Lys u Boc-D-Nal-Cys(Acm )-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-smola prema koraku (i), kako bi se dobio kompletan peptidni produkt na smoli formule H-D- - Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-smola.
Poželjna metoda, povezana s neposredno prethodnom metodom, uključuje cijepanje peptida H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr iz čvrste smole izvođenjem reakciju H-D-βNal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-smole s amonijakom u otapalu koje sadrži alkohol i izborno aprotonsko polarno otapalo da se uglavnom dovrši eliminacija da se dobije H-D --Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2.
Preferirani postupak, povezan s neposredno prethodnim postupkom, je onaj u kojem je alkohol metanol, a polarno neprotično otapalo je dimetilformamid.
Poželjna metoda, povezana s neposredno prethodnom metodom, uključuje istovremeno uklanjanje Acm skupina koje štite Cys i ciklizaciju rezultirajućih deprotektiranih Cys ostataka u potpunom peptidnom proizvodu formule H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D -Trp-Lys-Val -Cys(Acm)-Thr-NH 2 izvođenjem reakcije H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 s otopinom joda u alkoholu do gotovo potpunog uklanjanja zaštite i ciklizacije da se dobije H-D--Nal--Thr-NH2.
Poželjna metoda, povezana s neposredno prethodnom metodom, je metoda gdje je peptid H-D-Nal-Thr-NH2.
Poželjna metoda, povezana s neposredno prethodnom metodom, je ona u kojoj je peptid analog somatostatina.
Izrazi korišteni u opisu ovog izuma definirani su kako slijedi:
"prva aminokiselina": obuhvaća bilo koju aminokiselinu u kojoj je amino skupina u glavnom lancu (ne u bočnom) zaštićena s Boc, koji je komercijalni proizvod ili se može sintetizirati prema metodama poznatim osobama s uobičajenim iskustvom u području umjetnost, na primjer Boc-L-Thr;
"produkt prvog pričvršćivanja": opisuje proizvod koji je vezan na smolu krutog nosača koji je rezultat dodavanja prve aminokiseline na smolu krutog nosača, npr. Boc-L-Thr smola;
"deblokirani prvi produkt spajanja": opisuje proizvod koji nastaje uklanjanjem ili uklanjanjem Boc skupine iz prvog produkta spajanja - na primjer, H-L-Thr-smola, gdje je "H" raspoloživi vodik amino skupine glavne lanac, koji je rezultat koraka uklanjanja zaštite;
"sljedeća aminokiselina": opisuje bilo koju aminokiselinu u kojoj je amino skupina u glavnom lancu zaštićena s Boc ili Fmoc, koja je komercijalno dostupna ili se može sintetizirati prema metodama poznatim stručnjacima u ovom području tehnike. Budući da korak (c) i korak (e) mogu biti uključeni u ponavljajući ciklus gdje se korak izvodi više puta, svaki put kada se korak (c) ili korak (e) izvede, "sljedeća aminokiselina" može se neovisno odabrati iz skupina za koju je poznato ili je vjerojatno da će biti sintetizirana aminokiselina u kojoj je amino skupina u glavnom lancu zaštićena s Boc ili Fmoc;
"blokirani produkt (X+1)-tog sljedećeg pristupa": opisuje proizvod vezan za krutu potpornu smolu, koji je rezultat povezivanja sljedeće aminokiseline s "deblokiranim produktom sljedećeg pristupa". Budući da se koraci (c) i (d) i koraci (e) i (g) mogu uključiti u ciklus koji se ponavlja gdje se mogu pričvrstiti sljedeće aminokiseline, pojam "blokirani produkt (X+1) sljedećeg pričvršćivanja" odnosi se na proizvod dobiven kao rezultat svakog od prethodnih ciklusa pristupanja;
"deblokirani proizvod (X+1) sljedećeg pristupa": opisuje proizvod koji je rezultat uklanjanja Fmoc grupe iz "blokiranog proizvoda (X+1) sljedećeg pristupa";
„gotovi peptidni produkt na smoli”: opisuje peptidni produkt vezan za čvrstu potpornu smolu nakon što je N-terminalna aminokiselina pričvršćena na peptidni lanac i nakon što je amino skupina N-terminalne aminokiselinske okosnice deprotektirana ili deblokirana , ali koji još uvijek ima zaštitne skupine na funkcionalnim skupinama bočnih lanaca, koje nisu uklonjene reakcijom, provodeći uklanjanje zaštitne skupine s glavnog lanca N-terminalne aminokiseline; I
"gotovi peptidni produkt na deprotektiranoj smoli": opisuje peptidni produkt vezan za krutu smolnu podlogu gdje su sve zaštitne skupine uklonjene ili uklonjene zaštite s funkcionalnih skupina bočnih lanaca aminokiselina.
Primjeri kiselina koje se mogu koristiti za deprotekciju Boc su trifluoroctena kiselina (TFA), metansulfonska kiselina i organske otopine koje sadrže HCl.
Primjeri primarnih i sekundarnih amina koji se mogu koristiti za deprotekciju Fmoc su 4-(aminometil)piperidin, piperidin, dietilamin, DBU i tris(2-aminoetil)amin.
Primjeri nenukleofilnih baza koje se mogu koristiti za neutralizaciju TFA soli oslobođenih amino skupina (RNH 3 + CF 3 COO - ove soli moraju se pretvoriti u "slobodne" amine (NH 2) prije ili tijekom dodavanja sljedeće aminokiseline , inače se dodavanje neće dogoditi) su diizopropiletilamin (DIEA) i trietilamin (TEA).
Primjeri organskih otapala koja se mogu koristiti u reakcijama adicije aminokiselina su metilen klorid, kloroform, dikloroetan, dimetilformamid, dietilacetamid, tetrahidrofuran, etil acetat, 1-metil-2-pirolidon, acetonitril ili kombinacija ovih otapala.
Primjeri ekstendera peptida uključuju supstituirane karbodiimide kao što su: diizopropilkarbodiimid, dicikloheksilkarbodiimid ili N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid.
Karboksilne skupine i amino skupine koje sudjeluju u formiranju peptidne amidne veze nazivaju se karboksilna skupina "bočnog lanca", odnosno amino skupina. S druge strane, sve funkcionalne skupine aminokiselina koje ne sudjeluju u formiranju peptidne amidne veze nazivaju se funkcionalne skupine "bočnog lanca".
Pojam "skupina otporna na baze" odnosi se na zaštitne skupine koje se koriste za zaštitu funkcionalnih skupina aminokiselina koje (1) su otporne na baze, npr. ne mogu se ukloniti bazama kao što su 4-(aminoetil)piperidin, piperidin ili tris(2). -aminoetil)amin, koje su baze koje se obično koriste za uklanjanje Fmoc zaštitne skupine, i (2) mogu se ukloniti s kiselinom kao što je trifluoroctena kiselina ili drugom metodom kao što je katalitičko hidrogeniranje.
Simboli "Fmoc" i "Boc" korišteni su ovdje iu popratnoj formuli za označavanje 9-fluorenilmetoksikarbonila, odnosno t-butiloksikarbonila.
Gore opisana metoda može se koristiti za pripravu peptida, poželjno analoga somatostatina, kao što je Lanreotide® oktapeptid, koji ima sljedeću formulu: H-D--Nal--Thr-NH2. Ako se H-D--Nal--Thr-NH 2 treba sintetizirati, zaštitne skupine otporne na baze koje se koriste za zaštitu funkcionalnih skupina bočnog lanca Cys, Lys i Tyr mogu biti acetamidometil (Acm), Boc i tert-butil. Asm je poželjniji od Cys.
Pod analogom somatostatina misli se na peptid koji pokazuje biološku aktivnost sličnu (tj. agonist) ili suprotnu (tj. antagonist) onoj somatostatina.
U formuli H-D--Nal--Thr-NH2, svaki od uobičajenih troslovnih simbola aminokiselina (npr. Lys) odnosi se na strukturni aminokiselinski ostatak. Na primjer, simbol Lys u gornjoj formuli predstavlja -NH-CH((CH2)4NH2)-CO-. Simbol D- -Nal- predstavlja aminokiselinski ostatak D-2-naftilalanilil. Zagrade označavaju disulfidnu vezu koja povezuje slobodne tiole dva Cys ostatka u peptidu, što ukazuje da aminokiseline peptida unutar zagrada tvore ciklus.
Na temelju ovdje danog opisa, stručnjak će moći najpotpunije koristiti ovaj izum.
Osim ako nije drugačije definirano, svi tehnički i znanstveni izrazi koji se ovdje koriste imaju isto značenje koje uobičajeno razumiju stručnjaci u području na koje se ovaj izum odnosi. Nadalje, sve publikacije, patentne prijave, patenti i druge reference koje su ovdje citirane ovdje su uključene referencama na njih.
Peptid se može pripraviti u skladu s metodom ovog izuma prema sljedećem postupku.
Otopina od 0,5 molarnih ekvivalenata cezijevog karbonata u vodi polako se dodaje u otopinu od 1 molarnog ekvivalenta Boc-AA 1 (Bachem California, Torrance, CA) gdje AA 1 odgovara C-terminalnoj aminokiselini otopljenoj u alkoholu, poželjno metanol. Rezultirajuća smjesa je miješana oko 1 sat na sobnoj temperaturi, zatim su sav alkohol i sva voda uklonjeni pod sniženim tlakom kako bi se dobio suhi prah Boc-AA 1 cezijeve soli. Merifield smola, 1,0 ekvivalent (klor-metilirani polistiren, 200-400 mesh, inkorporacija kloridnih iona 1,3 meq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky ili Polymer Laboratories, Church Stretton, Engleska) ispere se s kloriranim otapalom, poželjno diklorometanom ( DCM ), alkohol, poželjno metanol, i polarno neprotično otapalo, poželjno dimetilformamid (DMF). Prašak cezijeve soli Boc-AA 1 otopi se u bezvodnom (suhom) polarnom aprotonskom otapalu, poželjno DMF-u, i otopina se pomiješa s prethodno ispranom smolom. Suspenzija se lagano miješa na oko 45°-65°C, poželjno na 50°-60°C, oko 48 do 106 sati, poželjno 85 do 90 sati, pod inertnom atmosferom kao što je dušik. Smola se odvoji filtracijom i temeljito ispere s polarnim aprotonskim otapalom, poželjno DMF-om, vodom i konačno alkoholom kao što je MeOH. Boc-AA 1 smola se suši pod smanjenim tlakom.
Boc-AA 1 smola se uvodi u stakleni reaktor s filterskim dnom od grubo taljenog stakla. Smola se ispere kloriranim otapalom kao što je DCM, deblokira se organskom kiselinom, poželjno 25% TFA u DCM-u, kratko se ispere kloriranom otopinom kao što je DCM i alkoholom kao što je MeOH, neutralizira se organskom bazom, poželjno trietilaminom u DCM, i ponovno ispran s DCM i polarnim aprotonskim otapalom kao što je DMF da se dobije AA 1 smola bez zaštite.
Bilo koji željeni broj aminokiselina se zatim po izboru veže na AA 1 smolu kojoj je uklonjena zaštita. Ako sljedeća aminokiselina ima α-amino skupinu s Fmoc zaštitom (Fmoc-AA x), tada skupina bočnog lanca ili ne zahtijeva zaštitu (na primjer, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe ili Fmoc- Thr) ili bočni lanac radi.zaštitite skupinom otpornom na bazu. Molarni višak Fmoc-AA x (gdje je x broj položaja aminokiseline u peptidu, računajući od C-završetka) je vezan otprilike 60 minuta za deprotektiranu AA 1 smolu s reagensom za rast peptida kao što je diizopropilkarbodiimid (DIC), u smjesi DCM/DMF. Dodatna smola je isprana s DMF, alkoholom i DCM da se dobije Fmoc-AA x -AA 1 smola. Pričvršćivanje se može provjeriti Kaiser ninhidrin metodom. Zatim se Fmoc-AA x -AA 1 smola ispere jednom s DMF-om i zatim deblokira otopinom baze u organskom otapalu kao što je piperidin u DMF-u da se dobije AA x -AA 1 smola. AA x -AA 1 smola se zatim ispere s DMF-om, nakon čega slijedi ispiranje nekoliko puta s alkoholom kao što je MeOH i DCM. Nakon toga, AA x -AA1 smola se ispire jednom s DMF-om oko 3 minute, tri puta s izopropanolom, poželjno oko 2 minute svaki put, i tri puta s DCM-om, poželjno oko 2 minute svaki put. Smola je tada spremna za daljnje pričvršćivanje Fmoc-zaštićene aminokiseline kao što je gore opisano ili Boc-zaštićene aminokiseline kao što je dolje opisano.
Slično, ako se bilo koja sljedeća aminokiselina koja se veže na deprotektiranu AA 1 smolu odabere sa zaštićenom Boc-amino skupinom (Boc-AA x), tada ili nije potrebna zaštita za skupinu bočnog lanca (to može biti Boc-Gly , Boc-Ala, Boc-Phe ili Boc-Thr), ili bočni lanac mora biti zaštićen grupom otpornom na uklanjanje i kiselinom i bazom, što može biti Boc-Cys(Acm). Ako se odabere Boc-AA x, pričvršćuje se korištenjem istih reagensa i otapala kao što je gore opisano za Fmoc-aminokiseline, a potpunost (dovršenost) pričvršćivanja može se provjeriti metodom Kaiser ninhidrin. Nakon toga, sa Boc-AA x -AA 1 smole se uklanja zaštita kiselom otopinom u organskom otapalu kao što je TFA u DCM da se dobije CF 3 CO - H + -AA x -AA 1 smola. Ova smola se zatim ispere nekoliko puta s kloriranim otapalom kao što je DCM, alkoholom kao što je MeOH i neutralizira s nenukleofilnom bazom kao što je trietilamin u DCM-u, a zatim se ispere još nekoliko puta s kloriranim otapalom kao što je DCM da se dobije AA x -AA 1 - smola. Smola je tada spremna za daljnje pričvršćivanje zaštićene Boc ili Fmoc aminokiseline kao što je gore opisano.
Ovisno o željenoj sekvenci peptida i tipu upotrijebljene aminokiseline zaštićene α-amino (bilo Fmoc zaštićene ili Boc zaštićene), koristi se odgovarajuća kombinacija gore navedenih postupaka pričvršćivanja, ovisno o tome koja aminokiselina treba sudjelovati u peptidni slijed - bočni lanac, koji ima zaštitnu skupinu koja se može ukloniti ili s bazom potrebnom za uklanjanje Fmoc iz α-amino skupine, ili s kiselinom potrebnom za uklanjanje Boc iz α-amino skupine. Takva zaštićena aminokiselina može biti N-β-Boc-N″-β-Fmoc-lizin ili N-β-Fmoc-N″-β-Boc-lizin. Ako je to slučaj, sve odabrane zaštitne skupine za α-amino skupine sljedećih aminokiselina, do N-terminalne aminokiseline, moraju biti kompatibilne sa zaštitom bočne skupine odabranom za tu poziciju. To znači da zaštitne skupine bočnog lanca moraju biti otporne na sredstvo za deblokiranje koje se koristi za uklanjanje zaštite s α-amino skupina sljedećih aminokiselina. Za N-terminalnu aminokiselinu, ili Boc ili Fmoc mogu se koristiti kao α-amino zaštita, budući da deprotekcija N-terminalne aminokiseline može istovremeno deprotektirati neke od zaštićenih bočnih lanaca bez nepoželjnog utjecaja na strategiju sinteze peptida, jer ne aminokiseline su više dostupne.
Završeni peptidni lanac, koji je još uvijek vezan za smolu, mora biti deprotektiran i otpušten. Za uklanjanje svih zaštitnih skupina otpornih na baze i α-amino blokirajuće skupine N-terminalne aminokiseline, ako je primjenjivo, peptid na smoli se tretira s kiselinom u organskom otapalu kao što je TFA u DCM-u. Kako bi se uklonile sve zaštitne skupine otporne na kiseline i α-amino blokirajuće skupine N-terminalne aminokiseline, ako je primjenjivo, peptid na smoli se tretira s organskom bazom kao što je piperidin u DMF-u. Alternativno, skupine otporne na kiselinu mogu se zadržati dok se ne uklone nakon naknadnog cijepanja peptida s amonijakom ili aminskom bazom. Peptid na deprotektiranoj smoli se zatim ispere s kloriranim otapalom kao što je DCM, alkoholom kao što je MeOH i suši do konstantne težine pod sniženim tlakom.
Peptid se odcijepi od smole i C-terminus se pretvori u amid suspendiranjem peptida na smoli u 3:1 MeOH/DMF. Suspenzija se ohladi na temperaturu ispod oko 10°C u atmosferi dušika i bezvodni plin amonijak se uvodi ispod površine otapala dok se otopina ne zasiti njime, dok se temperatura održava ispod oko 10°C. Suspenzija se lagano miješa oko 24 sata dok se ostavlja da temperatura poraste do oko 20°C. Stupanj dovršenosti reakcije provjerava se nestankom međuprodukta metil estera u HPLC pod odgovarajućim uvjetima ovisno o vrsti peptida. reakcijska smjesa ohladite i dodajte potrebnu količinu bezvodnog amonijaka sve dok HPLC površina vrha koja odgovara metilnom esteru ne bude manja od 10% površine vrha ciljanog produkta. Suspenzija je ohlađena ispod oko 10°C i miješanje je nastavljeno preko noći da se precipitira peptid. Talog i smola se odvoje filtracijom i isperu s hladnim MeOH. Talog i smola se suše pod smanjenim tlakom, produkt se ekstrahira iz smole vodenom otopinom octene kiseline.
Ako peptid sadrži zaštićene Cys ostatke u svojoj sekvenci, tiolne skupine se mogu ukloniti i ostaci se cikliziraju prema sljedećem postupku. Peptid koji sadrži zaštićene Asm skupine Cys otopi se u vodenoj otopini octene kiseline u atmosferi dušika. Otopina se brzo promiješa i odjednom se doda otopina joda u alkoholu. Smjesa se miješa i HPLC-om provjeri potpuno uklanjanje zaštite. Zatim se reakcija zaustavlja titracijom s 2% otopinom natrijevog tiosulfata dok ne nestane boja otopine. Sirova smjesa je pročišćena preparativnom kromatografijom na C8 ulošku s gradijentom acetonitrila u 0,1 amonij acetatnom puferu, odsoljena na C8 ulošku s gradijentom acetonitrila u 0,25 N octene kiseline i liofilizirana da se dobije ciljni peptid.
Primjer izvedbe izuma
Sljedeći primjer je dan da ilustrira metodu ovog izuma i ne treba ga se tumačiti kao ograničavajući njegov opseg.
Primjer 1. H2-D- -Nal--Thr-NH2
A) Boc-L-Thr-smola
Otopina od 2,58 g cezijevog karbonata u 2,5 ml vode polako je dodana u otopinu od 3,48 g Boc-L-treonina (Bachem California, Torrance, CA) otopljenog u 7 ml metanola. Rezultirajuća smjesa je miješana približno 1 sat na sobnoj temperaturi, zatim su sav metanol i sva voda uklonjeni pod sniženim tlakom kako bi se dobio suhi prah Boc-L-treonin cezijeve soli. 10 g Maryfield smole (klorometilirani polistiren, 200-400 mesh, ugradnja klora 1,3 meq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky) isprano je diklormetanom (DCM), metanolom (MeOH) i dimetilformamidom (DMF) (svaki 2 puta 70 ml). Boc-L-treonin prah cezijeve soli je otopljen u 60 ml suhog DMF-a i otopina je pomiješana sa smolom ispranom kao gore. Suspenzija je lagano miješana na temperaturi od približno 50°-60°C približno 85 do 90 sati u atmosferi dušika. Smola je odvojena filtracijom i temeljito isprana s DMF-om, deioniziranom vodom i konačno s MeOH. Boc-treoninska smola je osušena pod smanjenim tlakom na približno 40°C. Uključivanje treonina bilo je 0,85±0,15 meq/g suhe smole.
B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-smola
2,0 g Boc-treoninske smole iz koraka (A) uvedeno je u stakleni reaktor od 50 ml s dnom filtera od grubog taljenog stakla (opterećenje 1,74 mmol). Smola je isprana 2 puta s DCM (20 ml), svaki put približno 5 minuta, deblokirana s 25% TFA u DCM (30 ml) - prvi put približno 2 minute i drugi put približno 25 minuta, isprana 3 puta oko 2 minute DCM (20 ml), izopropanol (20 ml) i DCM (20 ml), neutralizirano dva puta po približno 5 minuta s 10% trietilamina u DCM (20 ml), isprano 3 puta po približno 2 minute s DCM i ispira se jednom s DMF (20 ml) oko 5 min.
U deblokiranu smolu dodano je 1,8 g (4,35 mmol, 2,5 ekv.) Fmoc-L-cisteina (Acm) (Bachem, CA) i 683 μl (4,35 mmol, 2,5 ekv.) diizopropil-karbodiimida (DIC) u 14 ml 2:1 DCM/DMF otprilike 1 sat 2 min DXM (20 ml). Vezanje je provjereno Kaiser nihidrinskom metodom.
Nakon pričvršćivanja, smola je isprana 1 put s DMF-om i zatim deblokirana otopinom piperidina u DMF-u. Deblokirana smola je zatim isprana s DMF-om i isprana nekoliko puta istovremeno s MeOH i DCM. Smola za spajanje je isprana 1 puta oko 3 minute s DMF-om (20 ml), 3 puta oko 2 minute s izopropanolom (20 ml) i 3 puta s DCM (20 ml) svaki put oko 2 minute. Vezanje je ispitano Kaiser ninhidrin metodom.
Svaka od sljedećih zaštićenih aminokiselina pričvršćena je na ispranu smolu korištenjem DIC u DMF/DCM i otpuštena kako je gore opisano u sljedećem nizu: Fmoc-L-valin, Fmoc-L-lizin (Boc), Fmoc-D-triptofan, Fmoc-L-tirozin (O-t-Bu) i Fmoc-L-cistein (Acm) (svi iz Bachem California), Boc-D-2-naftilalanin (Synthethech, Albany, OR).
Završeni peptidni lanac je deblokiran i dva puta zaštićen sa 75:20:5 DCM/TFA/anizolom (30 ml) oko 2 minute i oko 25 minuta, ispran 3 puta oko 2 minute svaki put s DCM (20 ml), izopropanolom (10 ml) i DCM (20 ml), neutraliziran 2 puta oko 5 min s 10% trietilamina u DCM (20 ml) i ispran 3 puta oko 2 min s DCM (20 ml) i MeOH (20 ml). Smola je osušena pod smanjenim tlakom. Suha težina bila je 3,91 g (103% teoretskog prinosa).
B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2
2,93 g smole napunjene peptidom iz koraka (B) (1,3 mmol-ekv.) suspendirano je u 50 ml smjese 3:1 MeOH/DMF. Suspenzija je ohlađena na temperaturu ispod oko 10°C u atmosferi dušika i suhi plinoviti amonijak je propuhan dok otopina nije njime bila zasićena, dok je temperatura održavana ispod oko 10°C. Suspenzija je lagano miješana oko 24 sata, dopuštajući da temperatura poraste do oko 20°C. Stupanj dovršenosti reakcije provjeren je nestankom međuprodukta metil etera pomoću HPLC (sorbent VYDAC®, veličina zrna 5 μm, veličina pora 100 Å, C18, izokratsko eluiranje s 26% CH 3 CN u 0,1% TFA, brzina 1 ml/min, snimanje na 220 mm; pod ovim uvjetima, vrijeme usporavanja Rt ~ 14 min za metil ester i ~ 9,3 min za amidni produkt). Reakcijska smjesa je ohlađena i dodan je suvišak bezvodnog amonijaka sve dok površina pika koja odgovara metilnom esteru na HPLC nije bila manja od 10% površine pika željenog produkta. Suspenzija je ohlađena na temperaturu ispod približno 10°C, miješanje je nastavljeno preko noći da se istaloži peptid. Talog i smola su odvojeni filtracijom i isprani sa 15 ml hladnog MeOH. Talog i smola su osušeni pod smanjenim tlakom, produkt je ekstrahiran iz smole s 50% vodenom otopinom octene kiseline (3 x 30 ml). HPLC analiza je pokazala 870 mg (0,70 mmol) naslovnog produkta (96% čistoće u izokratskoj HPLC) u smjesi.
D) H-D- -Nal--Thr-NH 2
500 mg (0,40 mmol) peptida iz koraka (B) otopljeno je u 300 ml 4% octene kiseline i zagrijano do oko 55°C pod dušikom. Otopina je brzo miješana i u jednom obroku je dodana 2% w/v otopina joda u 7,7 ml MeOH (0,60 mmol). Smjesa je miješana približno 15 minuta, zatim je reakcija zaustavljena titracijom s 2% otopinom natrijevog tiosulfata sve dok boja nije nestala (~2 ml). Smjesa je ohlađena na sobna temperatura i filtriran. Smjesa je pročišćena preparativnom kromatografijom na koloni C8 (YMC, Inc., Wilmington, NC) s gradijentom acetonitrila u 0,1 M amonijevom acetatu, odsoljena na koloni C8 YMC s gradijentom acetonitrila u 0,25 N octene kiseline, i liofiliziran kako bi se dobilo 350 mg ciljanog peptida 99% čistoće.
Na temelju gornjeg opisa, stručnjak može lako prepoznati bitne značajke ovog izuma i, bez odstupanja od njegovog duha i opsega, napraviti različite izmjene i modifikacije izuma kako bi ga prilagodio različitim primjenama i uvjetima. Prema tome, druge izvedbe izuma također su obuhvaćene zahtjevima.
ZAHTJEV
1. Metoda za preparaciju peptida formule H-D-Nal-Thr-NH2, naznačena time, da navedena metoda uključuje sljedeće korake:
(a) spajanje prve aminokiseline na krutu nosivu smolu eterskom vezom kako bi se formirao "prvi produkt spajanja", što uključuje (i) reakciju vodene otopine cezijevog karbonata s alkoholnom otopinom prve aminokiseline da bi se formirala cezijeva sol prve aminokiseline, (ii) dobivanje cezijeve soli prve aminokiseline bez otapala, (iii) reakcija krute potporne smole s cezijevom soli prve aminokiseline u bezvodnom polarnom aprotonskom otapalu da se dobije "prvi dodatni proizvod",
gdje je prva aminokiselina Boc-L-Thr, koja odgovara C-terminalnoj aminokiselini ovog peptida, a smola čvrstog medija je smola klorometiliranog polistirena;
(b) deprotektiranje Boc-a s produkta prve adicije s kiselinom da se dobije "produkt prve adicije bez zaštite";
(c) Po izboru, dodavanje "sljedeće aminokiseline" "deblokiranom prvom proizvodu vezivanja", što uključuje reakciju "sljedeće aminokiseline" s "deblokiranim prvim proizvodom vezivanja" u organskom otapalu koje sadrži reagens za rast peptida kako bi se dobio "blokirani sljedeći aminokiselinski proizvod". dodavanje", pri čemu "sljedeća aminokiselina" ima Boc-blokiranu amino skupinu u glavnom lancu, a ako ta "sljedeća aminokiselina" ima jednu ili više funkcionalnih skupina u bočnom lancu, tada funkcionalne skupine u bočnom lancu ne zahtijevaju zaštitu ili te funkcionalne skupine u bočnom lancu imaju zaštitne skupine koje su stabilne prema kiselim ili alkalnim sredstvima za uklanjanje zaštite, Boc i Fmoc;
(d) uklanjanje Boc zaštite od "blokiranog sljedećeg proizvoda" što uključuje reakciju "blokiranog sljedećeg proizvoda" s kiselinom da se dobije "deblokirani sljedeći proizvod";
(e) izborno, ponavljanje koraka (c) i (d), sa svakim ciklusom koji proizvodi "deblokirani produkt (X+1) sljedećeg vezanja", gdje je X broj ciklusa koji se žele ponoviti;
(e) dodavanje "sljedeće aminokiseline" "deblokiranom produktu prve veze" iz koraka (b) ili, izborno, "deblokiranom produktu (X+1) sljedeće veze" iz koraka (e), što uključuje izvođenje reakcije "sljedeće aminokiseline" sa specificiranim "deblokiranim produktom prvog vezivanja" ili sa specificiranim "deblokiranim produktom (X + 1) sljedećeg vezanja" u organskom otapalu koje sadrži reagens za rast peptida da se dobije "blokirani produkt sljedećeg pričvršćivanja", a ta "sljedeća aminokiselina" ima Fmoc blokiranu amino skupinu glavnog lanca, pod uvjetom da ako ta "sljedeća aminokiselina" ima jednu ili više funkcionalnih skupina u bočnom lancu, tada funkcionalne skupine u bočnom lancu ne zahtijevaju zaštitu, ili funkcionalne skupine u bočnom lancu imaju zaštitne skupine koje su otporne na alkalne reagense koji se koriste za deprotekciju Fmoc;
(g) uklanjanje zaštite "blokiranog sljedećeg produkta" Fmoc, što uključuje reakciju "blokiranog sljedećeg proizvoda" s primarnim ili sekundarnim aminom da se proizvede "deblokirani sljedeći produkt";
(h) izborno, ponavljanje koraka (e) i (g), sa svakim ciklusom koji proizvodi "deblokirani proizvod (X+1) sljedećeg dodatka", gdje je X željeni broj ponavljanja ciklusa dok se ne uključe u oslobađa se peptid i pretposljednja aminokiselina;
(i) dodavanje N-terminalne aminokiseline "deblokiranom proizvodu (X+1) sljedećeg pristupa", što uključuje reakciju N-terminalne aminokiseline s "deblokiranim proizvodom (X+1) sljedećeg pristupanje" u organskom otapalu koje sadrži reagens za produženje peptida kako bi se formirao "blokirani produkt potpunog vezanja" gdje "N-terminalna aminokiselina" ima okosnicu amino skupine blokiranu s Boc ili Fmoc;
(j) deprotekciju Boc ili Fmoc s "blokiranog kompletnog produkta" što uključuje reakciju "blokiranog kompletnog produkta" s kiselinom u slučaju Boc ili bazom u slučaju Fmoc da se formira kompletan peptidni produkt na smoli;
(j) ako "smolom-završeni peptidni produkt" ima funkcionalne skupine bočnog lanca, onda izborno uklanjanje zaštite s bočnog lanca "smolom-završenog peptidnog proizvoda", što uključuje reakciju "smolom-završenog peptidnog proizvoda" s odgovarajućim reagensima za uklanjanje zaštite proizvesti "potpuni peptidni produkt na smoli bez zaštite"; I
(k) cijepanje peptida od čvrstog smolastog nosača "gotovog peptidnog produkta na smoli" ili "finaliziranog peptidnog produkta na smoli bez zaštite" da bi se dobio peptid, što uključuje reakciju "gotovog peptidnog produkta na smoli" ili "gotovog peptidnog produkta na smoli" smola"; deprotektirana smola" s amonijakom, primarnim aminom ili sekundarnim aminom sve dok cijepanje peptida od smole nije gotovo potpuno;
pod uvjetom da se koraci (e) i (g) u sintezi peptida provode šest puta nakon stvaranja "deblokiranog produkta prvog vezivanja" formule H-L-Thr-smola, gdje su sljedeće aminokiseline vezane u redoslijed: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc -L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) i Fmoc-L-Cys( Acm) da nastane H-Cys(Acm)-Tyr (O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-smola.
2. Metoda prema zahtjevu 1, naznačena time što je amonijak, primarni amin ili sekundarni amin u koraku (k) u otapalu koje sadrži alkohol i izborno aprotonsko polarno otapalo.
3. Metoda prema zahtjevu 1, gdje korak (l) nadalje sadrži sljedeće korake:
(i) taloženje odcijepljenog peptida iz otapala;
(ii) filtriranje podloge od čvrste smole i istaloženog peptida, i
(iii) ekstrakciju peptida s kiselom otopinom da se izolira peptid.
4. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 do 3, naznačena time što je prva aminokiselina cezijeva sol Boc-L-Thr, čime se dobiva smola Boc-L-Thr kao prvi proizvod spajanja, i "deblokirani prvi produkt spajanja "je H-L-Thr -smola.
5. Metoda prema zahtjevu 4, naznačena time što je kiselina korištena za uklanjanje Boc zaštitne skupine u koraku (i) trifluoroctena kiselina (TFA).
6. Metoda prema zahtjevu 5, naznačena time što je organsko otapalo metilen klorid, kloroform ili dimetilformamid, a reagens za rast peptida je diizopropilkarbodiimid, dicikloheksilkarbodiimid ili N-etil-N"-(3-dimetil-aminopropil)karbodiimid.
7. Metoda prema zahtjevu 6, koja se sastoji od pričvršćivanja Boc-D-Nal na H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-smolu prema koraku (i) kako bi se dobila Boc-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-smola.
8. Metoda prema zahtjevu 7, koja se sastoji od istovremenog uklanjanja Boc skupine koja blokira D- -Nal, O-t-Bu skupine koja štiti Tyr i Boc skupine koja štiti Lys u Boc-D- -Nal-Cys(Acm)- Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-smola, u skladu s korakom (d) za dobivanje kompletnog peptidnog produkta na smoli formule H-D--Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-smola.
9. Metoda prema zahtjevu 8, naznačena time što se sastoji od cijepanja peptida H-D-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr od krute smole izvođenjem reakcije H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-smola s amonijakom u otapalu koje sadrži alkohol i po izboru aprotonsko polarno otapalo do suštinski potpune eliminacije da se dobije H-D-Nal -Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2.
10. Postupak prema zahtjevu 9, naznačen time, da je alkohol metanol, a polarno neprotično otapalo je dimetilformamid.
11. Metoda prema zahtjevu 10, koja se sastoji od istovremenog uklanjanja Acm skupina koje štite Cys i cikliziranja rezultirajućih deprotektiranih Cys ostataka u "potpuni peptidni produkt na smoli" formule H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D -Trp- Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 izvođenjem reakcije H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 s otopinom joda u alkoholu da se uglavnom dovrši deprotekcija i ciklizacija da se dobije H-D-Nal--Thr-NH2.
