Kiinteän faasin synteesi. Peptidien rakenne. Peptidisidoksen muodostumisreaktiot

Kombinatorinen synteesi voidaan suorittaa ei vain liuoksessa (nestefaasisynteesi), vaan myös kiinteän kemiallisesti inertin faasin pinnalla. Tällöin ensimmäinen lähtöaine "ommellaan" kemiallisesti polymeerikantajan pinnalla oleviin funktionaalisiin ryhmiin (useimmiten käytetään esteri- tai amidisidosta) ja käsitellään toisen lähtöaineen liuoksella, joka otetaan merkittävä ylimäärä, jotta reaktio menee loppuun. Tässä reaktiomuodossa on tietty mukavuus, koska tuotteiden eristystekniikka helpottuu: polymeeri (yleensä rakeiden muodossa) yksinkertaisesti suodatetaan pois, pestään perusteellisesti toisen reagenssin jäännöksistä ja kohdeyhdiste erotetaan. irrotettu siitä kemiallisesti.

Orgaanisessa kemiassa ei ole ainuttakaan reaktiota, joka käytännössä tarjoaisi kohdetuotteiden kvantitatiivisia saantoja joka tapauksessa. Ainoa poikkeus näyttää olevan orgaanisten aineiden täydellinen palaminen hapessa korkea lämpötila CO 2:ksi ja H 2 O:ksi. Siksi kohdetuotteen puhdistaminen on aina välttämätön ja usein vaikein ja aikaa vievin tehtävä. Erityisen vaikea tehtävä on peptidisynteesituotteiden eristäminen, esimerkiksi polypeptidien monimutkaisen seoksen erottaminen. Siksi peptidisynteesissä R. B. Merifieldin 1960-luvun alussa kehittämä synteesimenetelmä kiinteällä polymeerisubstraatilla on yleistynyt.

Polymeerikantaja Merrifield-menetelmässä on rakeinen silloitettu polystyreeni, joka sisältää bentseenirenkaissa kloorimetyyliryhmiä, jotka ovat linkkereitä, jotka sitovat kantajan polypeptidin ensimmäiseen aminohappotähteeseen. Nämä ryhmät muuttavat polymeerin bentsyylikloridin funktionaaliseksi analogiksi ja antavat sille kyvyn muodostaa helposti esterisidoksia reagoidessaan karboksylaattianionien kanssa. Tällaisen hartsin kondensaatio N-suojattujen aminohappojen kanssa johtaa vastaavien bentsyyliestereiden muodostumiseen. N-suojauksen poistaminen tuottaa C-suojatun johdannaisen ensimmäisestä aminohaposta, joka on kovalenttisesti liitetty polymeeriin. Vapautetun aminoryhmän aminoasylointi toisen aminohapon N-suojatulla johdannaisella, jota seuraa N-suojauksen poistaminen, johtaa samanlaiseen dipeptidijohdannaiseen, joka on myös sitoutunut polymeeriin:

Tällainen kaksivaiheinen sykli (suojauksen poisto - aminoasylointi) voidaan periaatteessa toistaa niin monta kertaa kuin tarvitaan tietynpituisen polypeptidiketjun rakentamiseksi.

Merifieldin ideoiden jatkokehitys kohdistui ensisijaisesti uuden löytämiseen ja luomiseen polymeerimateriaalit substraateille menetelmien kehittäminen tuotteiden erottamiseksi ja automatisoitujen tilojen luominen koko polypeptidisynteesin sykliä varten

Merifield-menetelmän tehokkuus on osoitettu useiden luonnollisten polypeptidien, erityisesti insuliinin, onnistuneella synteesillä. Erityisen selvästi sen edut on osoitettu ribonukleaasientsyymin synteesin esimerkillä. Niinpä esimerkiksi Hirschman ja 22 työntekijää suorittivat useiden vuosien aikana huomattavien ponnistelujen kustannuksella ribonukleaasientsyymin (124 aminohappotähdettä) synteesin perinteisillä nestefaasimenetelmillä. Melkein samanaikaisesti sama proteiini saatiin automaattisella kiinteäfaasisynteesillä. Toisessa tapauksessa synteesi, joka sisältää yhteensä 11 931 erilaista operaatiota, joista 369 kemialliset reaktiot, valmistui kaksi osallistujaa (Gatte ja Merrifield) vain muutamassa kuukaudessa.

Merrifieldin ideat toimivat perustana luomiselle erilaisia ​​menetelmiä eri rakenteiden polypeptidien kirjastojen kombinatorinen synteesi.

Joten vuonna 1982 ehdotettiin alkuperäistä strategiaa peptidien monivaiheiselle rinnakkaissynteesille kiinteässä faasissa, joka tunnetaan nimellä "jakomenetelmä". jakaa- halkaisu, erotus) tai "sekoita ja halkaise" -menetelmä (kuva 3). Sen olemus on seuraava. Oletetaan, että kolmesta aminohaposta (A, B ja C) sinun on saatava kaikki mahdolliset tripeptidien yhdistelmät. Tätä varten kiinteän polymeerikantajan (P) rakeet jaetaan kolmeen yhtä suureen osaan ja käsitellään yhden aminohapon liuoksella. Tässä tapauksessa kaikki aminohapot ovat kemiallisesti sitoutuneet polymeerin pintaan yhdellä niiden funktionaalisista ryhmistä. Saadut kolmen luokan polymeerit sekoitetaan perusteellisesti ja seos jaetaan jälleen kolmeen osaan. Sitten jokainen osa, joka sisältää kaikki kolme aminohappoa yhtä paljon, käsitellään jälleen yhdellä samoista kolmesta aminohaposta ja saadaan yhdeksän dipeptidiä (kolme kolmen tuotteen seosta kussakin). Toinen sekoitus, jakaminen kolmeen yhtä suureen osaan ja käsittely aminohapoilla antaa halutut 27 tripeptidiä (kolme yhdeksän tuotteen seosta) vain yhdeksässä vaiheessa, kun taas niiden saaminen erikseen vaatisi 27 × 3 = 81 vaiheen synteesin.

Kiinteäfaasisynteesi eli solid-faasitekniikka, jota usein kutsutaan keramiikaksi, on yleisin epäorgaanisten materiaalien tuotannossa eri tieteen ja teollisuuden aloille. Näitä ovat ydinpolttoaine, avaruusteknologian materiaalit, radioelektroniikka, instrumentointi, katalyytit, tulenkestävät aineet, korkean lämpötilan suprajohteet, puolijohteet, ferro- ja pietsosähköiset materiaalit, magneetit, erilaiset komposiitit ja monet muut.

Kiinteäfaasisynteesi perustuu kemiallisiin reaktioihin, joissa vähintään yksi reagoivista aineista on kiinteän aineen muodossa. Tällaisia ​​reaktioita kutsutaan heterogeenisiksi tai kiinteäksi faasiksi. Kiinteän faasin vuorovaikutus, toisin kuin reaktiot nestemäisessä tai kaasumaisessa väliaineessa, koostuu kahdesta perusprosessista: itse kemiallisesta reaktiosta ja aineen siirtymisestä reaktioalueelle.

Kiinteän olomuodon reaktioihin, joihin liittyy kiteisiä komponentteja, on tunnusomaista niiden atomien tai ionien rajoitettu liikkuvuus ja monimutkainen riippuvuus monista tekijöistä. Näitä ovat muun muassa reagoivien kiinteiden aineiden kemiallinen rakenne ja siihen liittyvä reaktiivisuus, vikojen luonne ja pitoisuus, reaktioalueen pinnan tila ja morfologia, vuorovaikutuksessa olevien reagenssien kosketusalue, alustava mekanokemiallinen aktivointi ja joukko muut. Kaikki yllä oleva määrittää heterogeenisten reaktioiden mekanismien monimutkaisuuden. Heterogeenisten reaktioiden tutkimus perustuu kiinteän aineen kemiaan, kemialliseen fysiikkaan ja kiinteiden aineiden pinnan fysikaaliseen kemiaan, termodynamiikan ja kineetiikan lakeihin.

Usein kiinteän olomuodon reaktioiden mekanismia arvioidaan vain sen perusteella, että kokeelliset tiedot vuorovaikutusasteesta ajan funktiona kuvataan parhaiten millä tahansa tietyllä kineettisellä mallilla ja vastaavalla kineettisellä yhtälöllä. Tämä lähestymistapa voi johtaa vääriin johtopäätöksiin.

Kiinteissä olomuotomateriaaleissa käytettävillä prosesseilla on useita tärkeitä eroja nesteiden tai kaasujen prosesseista. Nämä erot liittyvät ennen kaikkea merkittävästi (useita suuruusluokkia) pienempään diffuusionopeuteen kiintoaineissa, mikä estää komponenttien pitoisuuksien keskiarvon laskemisen järjestelmässä ja johtaa siten tapahtuvien prosessien avaruudelliseen lokalisoitumiseen. Spatiaalinen lokalisointi puolestaan ​​johtaa siihen, että sekä prosessin ominaisnopeus (tai diffuusiokerroin) että reaktioalueen geometria vaikuttavat prosessien havaittuun kinetiikkaan. Tällaisia ​​geometristen tekijöiden määräämiä kiinteän faasin prosessien ominaisuuksia kutsutaan topokemiallisiksi. Lisäksi, koska käsiteltävät muunnokset ovat spatiaalisesti paikallisia, niiden nopeus voidaan määrittää sekä itse prosessien avulla vaiherajalla (reaktion ohjaus) että minkä tahansa komponentin syöttönopeudella tähän rajapintaan tai tuotteen poistoon ( s) (diffuusiosäätö). Nämä tapaukset yksinkertaisille järjestelmille, joiden mallioletukset täyttyvät, voidaan tunnistaa kokeellisesti muunnosasteen aikariippuvuuden muodossa. Toinen kiinteiden aineiden faasimuunnosten piirre liittyy siihen, että uuden faasiytimen muodostuminen kiinteässä matriisissa aiheuttaa elastisten jännitysten ilmaantumista jälkimmäiseen, jonka energia on joissain tapauksissa otettava huomioon termodynamiikkaa tarkasteltaessa. näistä muutoksista.

Kiinteäfaasiprosessien kinetiikkaan ja näin saatujen materiaalien mikrorakenteeseen vaikuttavien tekijöiden suuri määrä määrää myös näiden prosessien luokittelutyyppien moninaisuuden. Näin ollen, kun otetaan huomioon järjestelmän stabiilisuus erityyppisten vaihteluiden suhteen, heterogeeniset (jos järjestelmät ovat stabiileja käytössä olevan tilavuuden pienille vaihteluille ja epävakaille suurille vaihteluille) ja homogeenisia (jos järjestelmät ovat epävakaita pieniin vaihteluihin) prosessit erotetaan toisistaan. Heterogeenisille prosesseille voidaan mainita esimerkkinä transformaatiot, jotka etenevät ytimien muodostumis- ja kasvumekanismin mukaan, homogeenisille prosesseille joitain järjestys-häiriösiirtymiä ja kiinteiden liuosten spinodaalista hajoamista.

Heterogeenisten prosessien tapauksessa on välttämätöntä erottaa heterogeeninen ja homogeeninen nukleaatio heterogeenisistä ja homogeenisista prosesseista. Heterogeeninen nukleaatio viittaa ytimien muodostumiseen rakenteellisiin virheisiin (mukaan lukien pistevirheet, sijoitukset ja vaiheen rajat); homogeeninen nukleaatio - ytimien muodostuminen kiinteän faasin virheettömässä tilavuudessa.

Analysoitaessa kiinteän faasin muunnoksen tuotetta, erotetaan yksivaiheiset ja monifaasiset ytimet. Monifaasisten ytimien tapauksessa prosessin tuote on monivaiheinen pesäke, jolla on tyypillinen mikrorakenne, jonka määrittää muodostuneiden faasien rajan pintaenergia; tämän tyyppisiä prosesseja kutsutaan epäjatkuviksi, toisin kuin jatkuvista prosesseista yksifaasisten ytimien muodostumisen ja kasvun tapauksessa.

Toinen tapa luokitella kiinteän faasin muunnoksia perustuu alkufaasin koostumuksen ja reaktiotuotteen koostumuksen vertailuun. Jos ne osuvat yhteen, ne puhuvat diffuusiovapaista prosesseista, ja jos koostumus muuttuu, he puhuvat diffuusiosta. Lisäksi on hyödyllistä erottaa ei-diffuusioprosesseista yhteistoiminnalliset prosessit (esimerkiksi martensiittiset muunnos), jotka tapahtuvat atomien samanaikaisen pienen siirtymän avulla suuressa alkuvaiheen tilavuudessa.

Diffuusiottomat faasimuunnokset voivat vaihdella prosessin aikana muuttuvien termodynaamisten ominaisuuksiensa tyypistä.

Ensimmäisen tyyppiset muunnokset ovat prosesseja, joissa kemiallisen potentiaalin johdannaisissa tapahtuu muutos lämpötilan tai paineen suhteen. Tämä tarkoittaa äkillistä muutosta tällaisten termodynaamisten parametrien, kuten entropian, tilavuuden, entalpian ja sisäisen energian, vaihemuutoksen aikana. Toisen tyyppisten muunnosten aikana kemiallisen potentiaalin ensimmäiset derivaatat intensiivisten parametrien suhteen eivät muutu, mutta korkeamman asteen derivaatat muuttuvat (toisesta alkaen). Näissä prosesseissa jatkuvalla entropialla ja järjestelmän tilavuudella tapahtuu äkillinen muutos Gibbsin energian toisina derivaattaina ilmaistuissa määrissä: lämpökapasiteetti, lämpölaajenemiskerroin, kokoonpuristuvuus jne.

Kiinteäfaasireaktiot kahden faasin välillä (kosketukset kolmen tai useamman faasin välillä ovat epätodennäköisiä ja vastaavat prosessit voidaan esittää useiden kaksifaasisten reaktioiden yhdistelminä) ovat diffuusioprosesseja ja voivat olla joko heterogeenisiä tai homogeenisia, joissa on sekä heterogeenistä että homogeenista ydintä . Homogeeniset prosessit ja prosessit, joissa on homogeeninen nukleaatio tällaisissa reaktioissa, ovat mahdollisia esimerkiksi silloin, kun muodostuu metastabiili kiinteä liuos ja sen myöhempi hajoaminen (ns. sisäiset reaktiot). Esimerkki tällaisista prosesseista voi olla sisäinen hapetus.

Termodynaamisen tasapainon ehto kiinteässä olomuodossa, kuten missä tahansa muussa kemiallisessa muunnoksessa, on lähtöaineiden ja reaktiotuotteiden komponenttien kemiallisten potentiaalien yhtäläisyys. Kahden kiinteän faasin vuorovaikutuksessa voidaan toteuttaa ilmoitettu kemiallisten potentiaalien yhtäläisyys eri tavoilla 1) komponenttien uudelleenjakautuminen alkuvaiheissa kiinteiden liuosten muodostumisen kanssa; 2) uusien faasien muodostuminen, joilla on erilainen kiderakenne (jota itse asiassa yleensä kutsutaan kiinteäfaasireaktioksi), ja koska komponentin kemiallinen potentiaali monifaasijärjestelmän eri vaiheissa ei riipu kidemäärästä. Jokainen vaihe tasapaino voidaan saavuttaa vain silloin, kun täydellinen transformaatio alkuvaiheet. Luotettavin tieto kiinteän faasin reaktioiden mekanismista saadaan monimutkaisella käytöllä, mikä mahdollistaa useiden reagoivan järjestelmän parametrien samanaikaisen tarkkailun, mukaan lukien faasikoostumus, lämpövaikutukset, massan muutokset ja paljon muuta.

Kiinteän olomuodon reaktioiden termodynaamisen teorian ehdotti Wagner, ja Schmalzried kehitti sitä edelleen käyttämällä esimerkkiä additioreaktioista.

Tähän mennessä ei ole olemassa yhtenäistä luokitusta useille heterogeenisille reaktioille. Tämä johtuu siitä, että on vaikea valita kriteeriä tällaisen yleismaailmallisen luokituksen perustaksi. Kemiallisten kriteerien mukaan reaktiot jaetaan hapettumis-, pelkistys-, hajoamis-, yhdistelmä-, vaihto- jne. reaktioihin. Ilmoitetun kriteerin ohella sitä käytetään laajalti reagenssien fysikaalisen tilan pääkriteerinä:

Kaikille heterogeenisille reaktioille tyypillinen piirre on olemassaolo ja sijainti reaktioalueen faasirajalla. Yleensä paksuudeltaan pieni reaktiovyöhyke erottaa kaksi tilan aluetta, jotka ovat koostumukseltaan eri aineilla. erilaisia ​​ominaisuuksia. Syyt reaktiovyöhykkeen muodostumiseen jaetaan yleensä kahteen ryhmään: diffuusioprosessien suhteellinen hitaus ja kemialliset syyt. Viimeinen ryhmä johtuu kiinteän reagenssin pinnalla tai kahden olemassa olevan faasin rajapinnalla olevien atomien tai molekyylien korkeasta reaktiivisuudesta. Tiedetään, että kiinteän tai nestemäisen aineen pinnalla on ominaisuuksia, jotka eroavat kompaktin näytteen bulkkiominaisuuksista. Tämä tekee käyttöliittymän ominaisuuksista erityisiä. Täällä tapahtuu merkittävä kidepakkauksen uudelleenjärjestely, jännitykset kahden kidehilan välillä pienenevät ja kemiallinen koostumus muuttuu.

Koska massansiirto tapahtuu diffuusion avulla ja kiinteiden hiukkasten diffuusioliikkuvuus riippuu sen rakenteen puutteellisuudesta, voidaan odottaa vikojen merkittävää vaikutusta kiinteän faasin reaktioiden mekanismiin ja kinetiikkaan. Tämä vaihe edeltää kemiallista vaihetta, jossa reagoivat aineet muuttuvat rajapinnan rajapinnassa. Siten heterogeenisten reaktioiden kinetiikka määräytyy sekä itse kemiallisen reaktion kulun luonteesta että menetelmästä, jolla aine toimitetaan reaktioalueelle. Edellä olevan mukaisesti reaktioiden nopeutta rajoittaa kemiallinen vaihe (kemiallinen kinetiikka) tai diffuusio (diffuusiokinetiikka). Tällainen ilmiö havaitaan todellisuudessa.

Wagnerin mukaan diffuusio ja siten reaktio kiinteissä aineissa tapahtuu pääasiassa ionien ja elektronien liikkuvuuden vuoksi, johtuen hilan epätasapainotilasta. Hilan eri ionit liikkuvat siinä eri nopeuksilla. Erityisesti anionien liikkuvuus on suurimmassa osassa tapauksia mitätön verrattuna kationien liikkuvuuteen. Siksi diffuusio ja vastaavasti reaktio kiinteissä aineissa tapahtuu kationien liikkeen vuoksi. Tässä tapauksessa erilaisten kationien diffuusio voi mennä samaan suuntaan tai toisiaan kohti. Erilailla varautuneiden kationien tapauksessa järjestelmän sähköneutraalisuus säilyy elektronien liikkeen ansiosta. Erilailla varautuneiden kationien liikenopeuksien eroista johtuen järjestelmään syntyy sähköpotentiaali. Tämän seurauksena liikkuvampien ionien liikenopeus laskee ja päinvastoin vähemmän liikkuvien? lisääntyy. Näin ollen tuloksena oleva sähköpotentiaali säätelee ionien diffuusionopeuksia. Jälkimmäinen ja sen määräämä koko solid-state-muunnosprosessin nopeus voidaan laskea elektronisen johtavuuden ja siirtolukujen perusteella. On selvää, että ionien suunnattu diffuusio on mahdollista vain sisällä sähkökenttä tai jos järjestelmässä on pitoisuusgradientti.

Kiinteässä tilassa olevien aineiden synteesissä on usein tarpeen valvoa tuloksena olevan tuotteen kemiallisen (alkuaine- ja faasi-) koostumuksen lisäksi myös sen mikrorakenneorganisaatiota. Tämä johtuu sekä kemiallisten (esimerkiksi aktiivisuus kiinteän faasin reaktioista) että monien fysikaalisten (magneettisten, sähköisten, optisten jne.) ominaisuuksien voimakkaasta riippuvuudesta kiinteän aineen rakenteellisen organisaation ominaisuuksista eri hierarkkisilla tasoilla. Ensimmäinen näistä tasoista sisältää kiinteän aineen alkuainekoostumuksen ja alkuaineiden atomien keskinäisen järjestäytymismenetelmän avaruudessa - kiderakenteen (tai amorfisten kiinteiden aineiden atomien lähimmän koordinaatioympäristön ominaisuudet), sekä koostumuksen ja pistevirheiden keskittyminen. Kiinteän kappaleen rakenteen seuraavana tasona voidaan tarkastella laajennettujen vikojen jakautumista kiteessä, joka määrittää niiden alueiden koot, joilla havaitaan (pistevikojen olemassaololla korjattu) translaatiosymmetriaa atomien järjestelyssä. . Tällaisia ​​alueita voidaan pitää täydellisinä mikrokiteinä ja niitä kutsutaan koherentin sironnan alueiksi. Koherentin sironnan alueista puhuttaessa on muistettava, että ne eivät yleensä vastaa kompakteja hiukkasia, jotka muodostavat kiinteän faasin materiaalin, joka voi sisältää huomattavan määrän laajennettuja vikoja ja siten koherentteja alueita. hajoaminen. Koherentin sironnan alueiden yhteensopivuus hiukkasten kanssa (joita tässä tapauksessa kutsutaan yksittäisalueiksi) havaitaan yleensä vain viimeksi mainittujen riittävän pienissä (alle 100 nm) kooissa. Myöhemmät rakenteelliset tasot voidaan liittää jauheen tai keraamisen materiaalin muodostavien hiukkasten muotoon ja kokojakaumaan, niiden aggregaatioon, primääristen aggregaattien aggregaatioon jne.

Kiinteän faasin materiaalien eri sovelluksilla on erilaiset, usein ristiriitaiset vaatimukset edellä luetelluille rakenteellisille ominaisuuksille, ja siksi ne vaativat erilaisia ​​synteettisiä menetelmiä. Siksi on oikeampaa puhua synteesimenetelmistä ei kiinteän faasin aineiden, vaan kiinteän faasin materiaalien synteesimenetelmistä ja valita kussakin tapauksessa synteesimenetelmä ottaen huomioon tuloksena olevan tuotteen myöhemmän käyttöalueen.

Yleisessä tapauksessa kiinteäfaasisten materiaalien synteesimenetelmät voidaan luokitella sen mukaan, kuinka paljon ne ovat etäisyyden termodynaamisista tasapainoolosuhteista käytettyjen kemiallisten prosessien virtauksessa. Yleisten lakien mukaisesti olosuhteissa, jotka vastaavat tilaa mahdollisimman kaukana tasapainosta, havaitaan muodostuneiden ytimien kasvunopeuteen nähden merkittävä ydintymisnopeuden ylitys, mikä ilmeisesti johtaa dispergoituneimman tuotteen saamiseen. Jos prosessi suoritetaan lähellä termodynaamista tasapainoa, jo muodostuneiden ytimien kasvu tapahtuu nopeammin kuin uusien muodostuminen, mikä puolestaan ​​​​mahdollistaa karkearakeisten (rajoittavassa tapauksessa yksikiteisten) materiaalien saamisen. Kiteiden kasvunopeus määräytyy myös pitkälti niiden laajennettujen (epätasapainoisten) vikojen pitoisuuden perusteella.

Kiinteäfaasisynteesi perustuu siihen tosiasiaan, että tulevan oligomeerin ensimmäinen lenkki on kovalenttisesti kiinnittynyt "ankkuri"ryhmään H., ketjun pidennys suoritetaan standardisuojatuilla monomeereillä liuoksissa synteesiin käytettyjen tavallisten kaavioiden mukaisesti. Lopuksi. synteesivaihe. oligomeeri lohkaistaan ​​N:sta ja puhdistetaan sopivilla menetelmillä. Pääasiassa käytetään kiinteäfaasisynteesiä. polypeptidien, oligonukleotidien ja oligosakkaridien saamiseksi.

Polypeptidien synteesin aikana N. naib. styreenin ja 1-2 % divinyylibentseenin kopolymeeriä käytetään laajalti, modifioituna lisäämällä dimetoksibentsyylikloridin ankkuriryhmä ensimmäisen aminohapon (suojatulla NH2-ryhmällä) kiinnittämiseksi C-päähän, esimerkiksi:

N-suojaryhmän poistamisen jälkeen polypeptidiketjun pidentäminen suoritetaan liuoksessa tapahtuvan peptidisynteesin standardimenetelmillä (katso Peptidit). Kondensointiaineina Naib. karbodi-imidejä käytetään usein tai aminohapot muunnetaan alustavasti aktivaattoriksi. eetterit.

Oligonukleotidien synteesissä nukleiinihappoina käytetään makrohuokoisia laseja tai silikageeliä. Ankkuriryhmä on karboksyyliryhmä, joka on erotettu N. spec. "jalka", esimerkiksi:

B-puriini tai pyrimidinen emäs

Ensimmäisessä vaiheessa nukleosidi kiinnittyy kantajaan deoksiriboosin 3"-hydroksyyliryhmästä, jossa asemassa 5 oleva hydroksyyliryhmä on suojattu dimetoksitrityyliryhmällä (CH3OS6H4)2(C6H). 5) C (DMTr); jälkimmäisen määrä sen halkeamisen jälkeen on helppo mitata spektrofotometrisesti, mikä toimii suurena. kantajan kuormitukselle ominaista ja antaa sinun arvioida saantoja oligonukleotidiketjun rakentamisen myöhemmissä vaiheissa. DMTr-ryhmän poistamisen jälkeen ketju kootaan käyttämällä fosfitamideja (fl. I; M. Kaposers, 1980) tai fosfonaatteja (hydrofosfonaatteja) (II; R. Stremberg, 1986):

Kiinteäfaasisynteesin toteuttamiseen tarvitaan korkeita tuottoja (tasolla 96-99 %) piirin jokaisessa vaiheessa sekä tehokkaita menetelmiä syntetisoitujen puhdistaminen ja eristäminen. yhteyksiä.

Kiinteän faasin käyttö mahdollistaa oligomeerin ketjun kasvun jokaisen vaiheen yksinkertaistamisen ja nopeuttamisen merkittävästi, koska ylimääräisten komponenttien, kondensaatioaineiden ja sivutuotteiden erottaminen liuoksessa saadaan aikaan suodattamalla reaktiot. seokset ja pesu N. sopivalla liuossarjalla. Siten oligomeeriketjun kokoamisprosessi jakautuu useisiin vakiotoimintoihin: ketjun kasvavan pään poistaminen, seuraavan suojatun monomeerin ja kondensointiaineen annostelu, tämän seoksen syöttäminen N.-kolonniin lasketun ajan ja pesu. ulos N. sopivalla liuottimella. Monomeerisen linkin rakentamisen sykli m. b. automatisoitu.

Automaattien ytimessä tanssiaiset. syntetisaattorit ovat yleisiä piirikaavio(katso kuva). Lukuisia Syntetisaattorimallit eroavat toisistaan ​​kolonnien suunnittelun ja lukumäärän, reagenssien ja liuottimien syöttötavan jne. suhteen. Ohjaus ja ohjelmointi suoritetaan sisäänrakennetulla tai etätietokoneella.

Automaattisen laitteen kaavio. tanssiaiset. syntetisaattorit (sähköinen ohjausviiva on merkitty katkoviivalla): 1 - monomeerien (M1, Mn) ja kondensoivan aineen (KA) syöttölinja; 2-linjainen reagenssien (esim. hapettimet, asylointiaineet, to-t jne.) ja p-liuottimien (P 1 , P n) syöttämiseen; 3 - kytkentäventtiilit; 4-kolonni, jossa materiaali, varustettu jakelulla. venttiili; 5-fotometrinen solu; 6 metriä; 7-ohjaus- ja ohjelmointiyksikkö; 8-näyttö.

Kiinteän faasin synteesin potentiaali osoitettiin ribonukleaasi A:n (R. Merrifield, 1969) ja ihmisen kasvuhormonin (D. Yamashiro, 1970), vastaavasti 124 ja 183 aminohapon synteesillä. Kuitenkin johtuen pienestä mutta jatkuvasta rasemisaatiosta, joka tapahtuu peptidisidoksen muodostumisen aikana, syntetisaattori. proteiinien biol. toimintaa, joten automaattinen. syntetisaattoreita käyttää Ch. arr. saada lyhyitä polypeptidejä (10-30 linkkiä), mukaan lukien preparatiiviset

Keksintö koskee kiinteäfaasimenetelmää kaavan H-D--Nal--Thr-NH2 mukaisen peptidin synteesiä varten, jossa menetelmässä käytetään sekä Boc-suojattuja että Fmoc-suojattuja aminohappoja ja kloorimetyloitua polystyreenihartsia. 10 z.p. lentää.

Tekniikan ala, johon keksintö kuuluu

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää peptidin valmistamiseksi, joka sisältää kolme tai useampia aminohappotähteitä, joissa on N-terminaalinen aminohappo, toiseksi viimeinen aminohappo N-terminaalisen aminohapon vieressä ja C-terminaalinen aminohappo.

Aikaisempi Art

Kiinteän faasin peptidisynteesi otettiin käyttöön vuonna 1963 monien peptidien liuossynteesiin liittyvien välivaiheen puhdistusvaiheiden ongelmien ratkaisemiseksi (Stewart et ai. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2. painos, 1984). Kiinteäfaasisynteesissä aminohapot kootaan (esim. liitetään) peptidiksi missä tahansa halutussa sekvenssissä, kun taas ketjun toinen pää (esim. C-pää) on kiinnittynyt liukenemattomaan kantajaan. Kun haluttu sekvenssi on koottu kantajalle (kantajalle), peptidi vapautetaan (eli katkaistaan) kantajasta. Kaksi standardia suojaavaa ryhmää liitettäville aminohappojen a-aminoryhmille ovat Boc, joka poistetaan vahvalla hapolla, ja Fmoc, joka poistetaan emäksellä. Esillä oleva keksintö koskee kätevää menetelmää peptidien valmistamiseksi käyttämällä näiden molempien suojausten yhdistelmää a-aminoryhmille yhdessä synteesissä edullisella hartsilla kloorimetyloidusta polystyreenistä.

Suunniteltaessa kiinteän faasin peptidisynteesiä käyttäen mitä tahansa edellä olevista a-aminosuojauskaavioista, on tärkeää, että kaikki peptidin muodostavien aminohappojen reaktiiviset "sivuryhmät" suojataan ei-toivotuilta kemiallisilta reaktioilta ketjun kokoamisen aikana. On myös toivottavaa, että P-aminoryhmien suojauksen poistamiseen käytetyt reagenssit eivät poista kemiallisia ryhmiä, jotka on valittu suojaamaan eri sivuryhmiä. Kolmanneksi on tärkeää, että kasvavan peptidiketjun sidos hartsipartikkeliin kestää reagensseja, joita käytetään ketjun kokoamisprosessissa kaiken tyyppisen a-aminosuojauksen poistamiseksi. Jos α-aminosuojausjärjestelmässä käytetään Fmoc:ia, sivuryhmän suojauksen on kestettävä Fmocin poistamiseen käytettyjä alkalisia reagensseja. Käytännössä nämä sivuketjun suojaryhmät poistetaan tavallisesti lievästi happamilla reagensseilla sen jälkeen, kun peptidiketjun kokoaminen on saatu päätökseen. Jos käytetään β-aminoryhmän suojausmenetelmää, jossa käytetään Boc:ta, sivuryhmän suojauksen on kestettävä heikosti hapanta reagenssia, jota käytetään Boc-ryhmän poistamiseen kussakin syklissä. Käytännössä nämä sivuketjun suojaryhmät p-aminosuojauskaaviossa Boc:n kanssa poistetaan tavallisesti vedettömällä HF:llä sen jälkeen, kun peptidiketjun kokoaminen on valmis. Siten käytännössä yleisesti käytetyt sivuketjun suojaryhmät a-aminosuojauskaaviossa Fmoc:lla eivät ole stabiileja olosuhteissa, joita käytetään a-aminoryhmien suojauksen poistamiseen Boc:lla. Siksi kahden tyyppisiä suojausjärjestelmiä a-aminoryhmille ei yhdistetä peptidiketjun kokoamisen aikana kiinteän faasin peptidisynteesissä. Lisäksi vaikka halvinta peptidisynteesissä käytettävää polymeerihartsia (kloorimetyloitua polystyreeniä tai "Maryfield-hartsia") käytetään laajalti yhdessä Boc-ryhmillä suojattujen aminohappojen kanssa, on kirjallisuudessa päätelty, että se ei sovellu suojaukseen. α-aminoryhmiä Fmoc-ryhmillä johtuen sen epästabiilisuudesta alkalisissa olosuhteissa (katso Stewart et ai. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2. painos, 1984). Esillä oleva keksintö koskee menetelmää tiettyjen peptidien yhteiskäyttöön sekä Boc-suojattujen että Fmoc-suojattujen aminohappojen kiinteäfaasisynteesissä Merifield-hartsilla.

Lanreotide®, joka on somatostatiinianalogi, tiedetään estävän kasvuhormonin vapautumista ja myös insuliinin, glukagonin ja eksokriinisen haiman eritystä.

US-patentti nro 4 853 371 esittää Lanreotide®:n, menetelmän sen valmistamiseksi ja menetelmän kasvuhormonin, insuliinin, glukagonin ja eksokriinisen haiman erittymisen estämiseksi, ja vaatii sitä.

US-patentti nro 5147856 esittää Lanreotide®:n käytön restenoosin hoitoon.

US-patentti nro 5411943 esittää Lanreotide®:n käytön hepatooman hoitoon.

US-patentti nro 5073541 esittää Lanreotide®:n käytön keuhkosyövän hoitoon.

US-patenttihakemus nro 08/089410, jätetty 9. heinäkuuta 1993, esittää Lanreotide®:n käytön melanooman hoitoon.

US-patentti nro 5 504 069 esittää Lanreotide®:n käytön kiihtyneen kiinteän kasvaimen kasvun estämiseksi.

US-patenttihakemus nro 08/854941, jätetty 13. toukokuuta 1997, esittää Lanreotide®:n käytön painonpudotukseen.

US-patenttihakemus nro 08/854 943, jätetty 13. toukokuuta 1997, esittää Lanreotide®:n käytön insuliiniresistenssin ja oireyhtymän X hoitoon.

US-patentti nro 5688418 esittää Lanreotide®:n käytön haimasolujen elinkyvyn pidentämiseen.

PCT-hakemus nro PCT/US 97/14154 esittää Lanreotide®:n käytön fibroosin hoitoon.

US-patenttihakemus nro 08/855311, jätetty 13. toukokuuta 1997, esittää Lanreotide®:n käytön hyperlipidemian hoitoon.

US-patenttihakemus nro 08/440061, jätetty 12. toukokuuta 1995, esittää Lanreotide®:n käytön hyperamylinemian hoitoon.

US-patenttihakemus nro 08/852221, jätetty 7. toukokuuta 1997, esittää Lanreotide®:n käytön hyperprolaktinemian ja prolaktinoomien hoitoon.

Keksinnön olemus

Esillä oleva keksintö tarjoaa menetelmän peptidin valmistamiseksi, joka sisältää kolme tai useampia aminohappotähteitä, joissa on N-terminaalinen aminohappo, toiseksi viimeinen aminohappo N-terminaalisen aminohapon vieressä ja C-terminaalinen aminohappo, mainitun menetelmän käsittäessä seuraavat vaiheet:

(a) kiinnitetään ensimmäinen aminohappo kiinteään kantajahartsiin eetterisidoksella ensimmäisen kytkentätuotteen muodostamiseksi, joka sisältää (i) cesiumkarbonaatin vesiliuoksen saattamisen reagoimaan ensimmäisen aminohapon alkoholiliuoksen kanssa cesiumsuolan muodostamiseksi ensimmäisen aminohapon cesiumsuolan saamiseksi, (ii) ensimmäisen aminohapon liuotinvapaan cesiumsuolan saamiseksi, (iii) kiinteän kantajahartsin saattaminen reagoimaan ensimmäisen aminohapon cesiumsuolan kanssa kuivassa (vedettömässä) polaarisessa aproottisessa liuottimessa muodostaen ensimmäinen lisätty tuote,

jossa ensimmäinen aminohappo vastaa peptidin C-terminaalista aminohappoa, Boc estää ensimmäisen aminohapon ei-sivuketjun (pääketjun) aminoryhmän ja ensimmäisellä aminohapolla ei ole funktionaalista ryhmää sivuketjussa, joka vaatii suojaa, ja kiinteä kantaja - hartsi - on kloorimetyloitua polystyreenihartsia;

b) Boc-suojauksen poisto (suojauksen poistaminen) ensimmäisen liittämisen tuotteesta hapolla, jolloin muodostuu ensimmäisen liittymisen tuote, josta suojaus on poistettu;

(c) valinnaisesti seuraavan aminohapon kiinnittäminen ensimmäiseen kiinnittymistuotteeseen, josta suojaus on poistettu, mikä sisältää seuraavan aminohapon reagoimisen ensimmäisen kiinnitystuotteen kanssa, josta suojaus on poistettu, orgaanisessa liuottimessa, joka sisältää peptidikasvatusreagenssia, jotta saadaan estetty (suojattu) seuraava kiinnitystuote, jolloin seuraavan aminohapon pääketjussa on Boc:n estämä aminoryhmä ja jos seuraavassa aminohapossa on yksi tai useampi funktionaalinen ryhmä sivuketjussa, niin sivuketjun funktionaaliset ryhmät eivät vaadi suojausta tai funktionaaliset ryhmät sivuketjussa on suojaryhmiä, jotka ovat resistenttejä happamille tai emäksisille reagensseille, joita käytetään suojan poistamiseen, vastaavasti, Boc ja Fmoc;

(d) Boc:n suojauksen poistaminen suojatusta seuraavasta additiotuotteesta, joka sisältää suojatun seuraavan additiotuotteen saattamisen reagoimaan hapon kanssa, jolloin saadaan seuraava suojaus poistettu;

(e) valinnaisesti toistetaan vaiheet (c) ja (d), jolloin jokainen sykli tuottaa vapautuneen tuotteen (X+1):nnestä seuraavasta kiinnityksestä, missä X on syklin vaaditun toiston lukumäärä;

(f) lisätään seuraava aminohappo vapautuneeseen ensimmäiseen kiinnittymistuotteeseen vaiheesta (b) tai valinnaisesti vapautuneeseen (X+1) seuraavaan kiinnitystuotteeseen vaiheesta (e), joka sisältää seuraavan aminohapon reagoimisen mainitun kanssa. ensimmäinen kiinnitystuote tai (X+1):nnen seuraavan kiinnityksen määritellyllä deblokoidulla tuotteella orgaanisessa liuottimessa, joka sisältää reagenssia peptidin kasvattamiseksi, jotta saadaan estetty (suojattu) seuraava kiinnitystuote, ja seuraavalla aminohapolla on pääketju Fmoc:n estämä aminoryhmä edellyttäen, että jos seuraavassa aminohapossa on yksi tai useampi funktionaalinen ryhmä sivuketjussa, niin sivuketjun funktionaaliset ryhmät eivät vaadi suojausta tai sivuketjun funktionaalisissa ryhmissä on suojaryhmiä, jotka ovat kestää Fmoc-suojauksen poistamiseen käytettyjä alkalisia reagensseja;

(g) Fmoc:n suojauksen poistaminen estetystä seuraavasta additiotuotteesta, joka sisältää suojatun seuraavan adduktin saamisen reagoimaan primaarisen tai sekundäärisen amiinin kanssa, jolloin saadaan seuraava additiote, josta suojaus on poistettu;

(h) valinnaisesti toistamalla vaiheet (e) ja (g) jokaisen syklin muodostaessa seuraavan (X+1):nnen lisäyksen eston poistetun tuotteen, jossa X on syklin tarvittavan toiston lukumäärä toiseksi viimeiseen sisältyy peptidiin ja aminohappoon, josta suojaus on poistettu;

(i) N-terminaalisen aminohapon kiinnittäminen suojauksesta poistettuun (X+1) seuraavaan liittymistuotteeseen, mikä sisältää N-terminaalisen aminohapon saattamisen reagoimaan suojauksesta poistetun (X+1) seuraavan liittymistuotteen kanssa orgaanisessa liuottimessa, joka sisältää peptidikasvatusreagenssi, jotta saadaan estetty lopputuote, jolloin N-terminaalisella aminohapolla on runkoaminoryhmä, jonka Boc tai Fmoc estää;

(j) Boc:n tai Fmoc:n suojauksen poistaminen estetystä täydellisestä additiotuotteesta, käsittäen estyneen valmiin additiotuotteen saattamisen reagoimaan hapon kanssa Boc:n tapauksessa tai emäksen kanssa Fmoc:n tapauksessa valmiin peptidituotteen muodostamiseksi hartsille;

(j) jos hartsilla olevassa valmiissa peptidituotteessa on sivuketjun funktionaalisia ryhmiä, sitten hartsilla olevan valmiin peptidituotteen sivuketjun funktionaalisten ryhmien suojauksen poistaminen, mikä sisältää hartsilla olevan valmiin peptidituotteen reagoimisen sopivien suojauksenpoistoreagenssien kanssa valmis peptidituote hartsilla poistettu suoja; Ja

(k) peptidin lohkaiseminen valmiin peptidituotteen kiinteästä hartsikantajasta hartsilla tai valmiista peptidituotteesta hartsilla, josta suojaus on poistettu, peptidin saamiseksi, mikä käsittää valmiin peptidituotteen hartsilla tai valmiin peptidituotteen saamisen reagoimaan ammoniakin kanssa primaarinen amiini tai sekundaarinen amiini peptidin hartsista katkaisun käytännön loppuun saattamiseen;

sillä ehdolla, että peptidin synteesin vaiheet (e) ja (g) on ​​suoritettava vähintään kerran.

Edullinen on esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä, jossa ammoniakki, primaarinen amiini tai sekundäärinen amiini vaiheessa (k) on liuottimessa, joka sisältää alkoholia ja valinnaisesti aproottista polaarista liuotinta,

Edullinen on esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä, jossa vaihe (l) sisältää lisäksi seuraavat vaiheet:

pilkotun peptidin saostaminen liuottimesta;

erotetaan suodattamalla kiinteä hartsikantaja ja saostunut peptidi, ja

peptidin uuttaminen happamalla liuoksella peptidin eristämiseksi.

Edullinen on esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä, jossa ensimmäinen aminohappo on Boc-L-Thr.

Edullinen on esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä, jossa ensimmäinen aminohappo on Boc-L-Thr:n cesiumsuola, jolloin saadaan Boc-L-Thr-hartsi ensimmäisenä kytkentätuotteena, ja ensimmäinen kytkentätuote, josta suojaus on poistettu, on H-L-Thr-hartsi. .

Edullinen on esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä, jossa Boc-suojaryhmän poistamiseen vaiheessa (vaiheissa) käytetty happo on trifluorietikkahappo (TFA).

Edullinen menetelmä, joka liittyy välittömästi edeltävään prosessiin, on se, että orgaaninen liuotin on metyleenikloridi, kloroformi tai dimetyyliformamidi ja peptidin kasvatusreagenssi on di-isopropyylikarbodi-imidi, disykloheksyylikarbodi-imidi tai N-etyyli-N"-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi. .

Edullinen menetelmä, joka liittyy välittömästi edeltävään menetelmään, on menetelmä, jossa vaiheet (e) ja (g) suoritetaan kuusi kertaa sen jälkeen, kun on muodostunut ensimmäinen kytkentätuote, jolla on kaava H-L-Thr-hartsi, jossa seuraavat aminohapot liitteenä järjestyksessä: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) ja Fmoc-L- Cys(Acm) tuotteen H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-hartsi muodostamiseksi.

Edullinen menetelmä, joka liittyy välittömästi edeltävään menetelmään, on menetelmä, joka käsittää Boc-D--Nal:n lisäämisen H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val- Cys(Acm)-Tnr-hartsi vaiheen (c) mukaisesti Boc-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Ast) saamiseksi -Thr-hartsi.

Edullinen menetelmä, joka liittyy välittömästi edeltävään menetelmään, sisältää Boc-ryhmän, joka suojaa D--Nal-, O-t-Bu-ryhmän suojaavan Tyr- ja Boc-ryhmän, suojaavan Lys-ryhmän Boc-D--Nal-Cys (Acm) poistamisen samanaikaisesti. )-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-hartsi vaiheen (i) mukaisesti valmiin peptidituotteen saamiseksi hartsille, jolla on kaava H-D-- Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-hartsi.

Edullinen menetelmä, joka liittyy välittömästi edeltävään menetelmään, käsittää H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-peptidin pilkkomisen kiinteästä hartsista suorittamalla reaktio H-D-βNal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm)-Thr-hartsi ammoniakin kanssa liuottimessa, joka sisältää alkoholia ja valinnaisesti aproottista polaarista liuotinta eliminaation oleellisen loppuunsaattamiseksi, jolloin saadaan H-D --Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2.

Edullinen menetelmä, joka liittyy välittömästi edeltävään prosessiin, on, jossa alkoholi on metanoli ja polaarinen aproottinen liuotin on dimetyyliformamidi.

Edullinen menetelmä, joka liittyy välittömästi edeltävään menetelmään, sisältää Acm:n suojaavien Cys-ryhmien samanaikaisen poistamisen ja tuloksena olevien Cys-tähteiden syklisoinnin valmiissa peptidituotteessa, jolla on kaava H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D. -Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 suorittamalla H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH:n reaktio. 2 jodiliuoksella alkoholissa suojauksen poistamiseksi ja syklisoimiseksi lähes täydelliseksi, jolloin saadaan H-D--Nal--Thr-NH2.

Edullinen menetelmä, joka liittyy välittömästi edeltävään menetelmään, on menetelmä, jossa peptidi on H-D--Nal--Thr-NH2.

Edullinen menetelmä, joka liittyy välittömästi edeltävään menetelmään, on sellainen, jossa peptidi on somatostatiinianalogi.

Esillä olevan keksinnön kuvauksessa käytetyt termit määritellään seuraavasti:

"ensimmäinen aminohappo": kattaa minkä tahansa aminohapon, jossa pääketjun (ei sivuketjun) aminoryhmä on suojattu Boc:lla, joka on kaupallinen tuote tai voidaan syntetisoida tavanomaisen ammattimiehen tuntemilla menetelmillä alalla esimerkiksi Boc-L-Thr;

"ensimmäinen kiinnitystuote": kuvaa tuotetta, joka on kiinnittynyt kiinteään kantajahartsiin, joka on seurausta ensimmäisen aminohapon lisäämisestä kiinteään kantajahartsiin, esim. Boc-L-Thr-hartsiin;

"ensimmäinen kytkentätuote, josta suojaus on poistettu": kuvaa tuotetta, joka syntyy Boc-ryhmän poistamisesta tai poistamisesta ensimmäisestä kytkentätuotteesta - esimerkiksi H-L-Thr-hartsi, jossa "H" on pääasiallisen aminoryhmän käytettävissä oleva vety. ketju, joka on tuloksena suojauksenpoistovaiheesta;

"seuraava aminohappo": kuvaa mitä tahansa aminohappoa, jossa pääketjun aminoryhmä on suojattu Boc:lla tai Fmoc:lla, joka on kaupallisesti saatavilla tai voidaan syntetisoida alan tavallisen ammattimiehen tuntemilla menetelmillä. Koska vaihe (c) ja vaihe (e) voidaan sisällyttää toistuvaan sykliin, jossa vaihe suoritetaan useammin kuin kerran, jokainen vaihe (c) tai vaihe (e) suoritetaan, "seuraava aminohappo" voidaan valita itsenäisesti seuraavista: ryhmä, jonka tiedetään tai todennäköisesti olevan syntetisoituja aminohappoja, joissa pääketjun aminoryhmä on suojattu Boc:lla tai Fmoc:lla;

"(X+1):nnen seuraavan liittymisen estetty tuote": kuvaa kiinteään kantajahartsiin kiinnittynyttä tuotetta, joka on seurausta seuraavan aminohapon liittämisestä "seuraavan liittymisen deblokoidun tuotteen kanssa". Koska vaiheet (c) ja (d) ja vaiheet (e) ja (g) voidaan sisällyttää toistuvaan sykliin, jossa seuraavat aminohapot voidaan kiinnittää, termi "seuraavan (X+1):nnen kiinnityksen estetty tuote" tarkoittaa tuotetta, joka on saatu kunkin edellisen liittymissyklin tuloksena;

"seuraavan X+1:nnen liittymisen estetty tuote": kuvaa tuotetta, joka on seurausta Fmoc-ryhmän poistamisesta "seuraavan X+1:nnen liittymisen estetystä tuotteesta";

"valmis peptidituote hartsilla": kuvaa peptidituotetta, joka on kiinnittynyt kiinteään kantajahartsiin sen jälkeen, kun N-terminaalinen aminohappo on kiinnitetty peptidiketjuun ja sen jälkeen, kun N-terminaalisen aminohapporungon aminoryhmä on poistettu tai suojattu , mutta jolla on vielä suojaryhmiä sivuketjujen funktionaalisissa ryhmissä, joita ei ole poistettu reaktiolla, suorittaen suojaryhmän poiston N-terminaalisen aminohapon pääketjusta; Ja

"täydellinen peptidituote hartsilla, josta suojaus on poistettu": kuvaa peptidituotetta, joka on kiinnitetty kiinteään hartsikantajaan, jossa kaikki suojaryhmät on poistettu tai suojattu aminohapposivuketjujen funktionaalisista ryhmistä.

Esimerkkejä hapoista, joita voidaan käyttää Boc:n suojauksen poistamiseen, ovat trifluorietikkahappo (TFA), metaanisulfonihappo ja orgaaniset liuokset, jotka sisältävät HCl:a.

Esimerkkejä primaarisista ja sekundaarisista amiineista, joita voidaan käyttää Fmoc:n suojauksen poistamiseen, ovat 4-(aminometyyli)piperidiini, piperidiini, dietyyliamiini, DBU ja tris(2-aminoetyyli)amiini.

Esimerkkejä ei-nukleofiilisistä emäksistä, joita voidaan käyttää neutraloimaan vapautuneiden aminoryhmien TFA-suoloja (RNH 3 + CF 3 COO - nämä suolat on muutettava "vapaiksi" amiineiksi (NH 2) ennen seuraavan aminohapon lisäämistä tai sen aikana , muuten lisäystä ei tapahdu) ovat di-isopropyylietyyliamiini (DIEA) ja trietyyliamiini (TEA).

Esimerkkejä orgaanisista liuottimista, joita voidaan käyttää aminohappolisäysreaktioissa, ovat metyleenikloridi, kloroformi, dikloorietaani, dimetyyliformamidi, dietyyliasetamidi, tetrahydrofuraani, etyyliasetaatti, 1-metyyli-2-pyrrolidoni, asetonitriili tai näiden liuottimien yhdistelmä.

Esimerkkejä peptidien jatkeista ovat substituoidut karbodi-imidit, kuten: di-isopropyylikarbodi-imidi, disykloheksyylikarbodi-imidi tai N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi.

Karboksyyliryhmiä ja aminoryhmiä, jotka osallistuvat peptidiamidisidoksen muodostumiseen, kutsutaan "sivuketjun" karboksyyliryhmäksi tai aminoryhmäksi, vastaavasti. Toisaalta mitä tahansa aminohappofunktionaalisia ryhmiä, jotka eivät osallistu peptidiamidisidoksen muodostumiseen, kutsutaan "sivuketjun" funktionaalisiksi ryhmiksi.

Termi "emäsresistentti ryhmä" viittaa suojaryhmiin, joita käytetään suojaamaan aminohappofunktionaalisia ryhmiä, jotka (1) ovat emäsresistenttejä, esim. joita ei voida poistaa emäksillä, kuten 4-(aminoetyyli)piperidiini, piperidiini tai tris(2) -aminoetyyli)amiini, jotka ovat emäksiä, joita yleisesti käytetään poistamaan Fmoc-suojaryhmä, ja (2) voidaan poistaa hapolla, kuten trifluorietikkahapolla, tai muulla menetelmällä, kuten katalyyttisellä hydrauksella.

Symboleja "Fmoc" ja "Boc" käytetään tässä ja oheisessa kaavassa merkitsemään 9-fluorenyylimetoksikarbonyyliä ja t-butyylioksikarbonyyliä, vastaavasti.

Edellä kuvattua menetelmää voidaan käyttää valmistamaan peptidejä, edullisesti somatostatiinianalogeja, kuten Lanreotide®-oktapeptidiä, jolla on seuraava kaava: H-D--Nal-Thr-NH2. Jos H-D--Nal--Thr-NH2 on syntetisoitava, Cys-, Lys- ja Tyr-sivuketjun funktionaalisten ryhmien suojaamiseen käytetyt emäsresistentit suojaryhmät voivat olla asetamidometyyliä (Acm), Boc:ta ja tert-butyyliä, vastaavasti. Asm on parempi kuin Cys.

Somatostatiinianalogilla tarkoitetaan peptidiä, joka osoittaa biologista aktiivisuutta, joka on samanlainen (eli agonisti) tai päinvastainen (eli antagonisti) kuin somatostatiinilla.

Kaavassa H-D--Nal-Thr-NH2 jokainen tavallinen kolmikirjaiminen aminohapposymboli (esim. Lys) viittaa rakenteelliseen aminohappotähteeseen. Esimerkiksi symboli Lys yllä olevassa kaavassa edustaa ryhmää -NH-CH((CH2)4NH2)-CO-. Symboli D--Nal- edustaa aminohappotähdettä D-2-naftyylialanilyyli. Hakasulkeet tarkoittavat disulfidisidosta, joka yhdistää kahden Cys-tähteen vapaat tiolit peptidissä, mikä osoittaa, että suluissa olevat peptidin aminohapot muodostavat syklin.

Tässä annetun kuvauksen perusteella alan ammattilainen pystyy käyttämään esillä olevaa keksintöä täydellisimmin.

Ellei toisin ole määritelty, kaikilla tässä käytetyillä teknisillä ja tieteellisillä termeillä on sama merkitys kuin esillä olevan keksinnön kohteena olevan alan tavanomaiset asiantuntijat ymmärtävät. Lisäksi kaikki tässä siteeratut julkaisut, patenttihakemukset, patentit ja muut viitteet sisällytetään tähän viittaamalla niihin.

Peptidi voidaan valmistaa esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti seuraavan menetelmän mukaisesti.

Liuos, jossa on 0,5 mooliekvivalenttia cesiumkarbonaattia vedessä, lisätään hitaasti liuokseen, jossa on 1 mooliekvivalenttia Boc-AA 1:tä (Bachem California, Torrance, CA), jossa AA1 vastaa C-terminaalista aminohappoa, joka on liuotettu alkoholiin, edullisesti. metanoli. Saatua seosta sekoitettiin noin 1 tunti huoneenlämpötilassa, sitten kaikki alkoholi ja kaikki vesi poistettiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin kuivaa Boc-AA1-cesiumsuolan jauhetta. Merifield-hartsi, 1,0 ekvivalenttia (kloorimetyloitu polystyreeni, 200-400 mesh, kloridi-ionin lisäys 1,3 mekv/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky tai Polymer Laboratories, Church Stretton, Englanti) pestään klooratulla liuottimella, mieluiten dikloorimetaanilla. ), alkoholi, edullisesti metanoli, ja polaarinen aproottinen liuotin, edullisesti dimetyyliformamidi (DMF). Cesiumsuolan Boc-AA1 jauhe liuotetaan vedettömään (kuivaan) polaariseen aproottiseen liuottimeen, edullisesti DMF:ään, ja liuos yhdistetään aiemmin pestyyn hartsiin. Lietettä sekoitetaan varovasti noin 45 - 65 °C:ssa, edullisesti 50 - 60 °C:ssa, noin 48 - 106 tuntia, edullisesti 85 - 90 tuntia, inertissä atmosfäärissä, kuten typessä. Hartsi erotetaan suodattamalla ja pestään perusteellisesti polaarisella aproottisella liuottimella, edullisesti DMF:llä, vedellä ja lopuksi alkoholilla, kuten MeOH. Boc-AA1-hartsi kuivataan alennetussa paineessa.

Boc-AA 1 -hartsi syötetään lasireaktoriin, jonka suodatinpohja on valmistettu karkeasta sulatetusta lasista. Hartsi pestään klooratulla liuottimella, kuten DCM, suojaus poistetaan orgaanisella hapolla, edullisesti 25-prosenttisella TFA:lla DCM:ssä, pestään lyhyesti klooratulla liuoksella, kuten DCM, ja alkoholilla, kuten MeOH, neutraloidaan orgaanisella emäksellä, edullisesti trietyyliamiinilla. DCM:llä ja pestiin jälleen DCM:llä ja polaarisella aproottisella liuottimella, kuten DMF:llä, jolloin saatiin AA1-hartsi, josta suojaus on poistettu.

Mikä tahansa haluttu määrä aminohappoja liitetään sitten valinnaisesti suojauksesta poistettuun AA1-hartsiin. Jos seuraavassa aminohapossa on α-aminoryhmä Fmoc-suojauksella (Fmoc-AA x), sivuketjuryhmä joko ei vaadi suojausta (esim. Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe tai Fmoc- Thr) tai sivuketju suojaa emäksenkestävällä ryhmällä. Fmoc-AA x:n molaarinen ylimäärä (jossa x on aminohapon paikkanumero peptidissä, laskettuna C-päästä) kiinnitetään noin 60 minuutin ajaksi suojauksesta poistettuun AA1-hartsiin peptidin kasvureagenssilla, kuten di-isopropyylikarbodi-imidillä. (DIC) DCM/DMF-seoksessa. Lisäyshartsi pestiin DMF:llä, alkoholilla ja DCM:llä, jolloin saatiin Fmoc-AA x-AA1 -hartsi. Kiinnitys voidaan tarkistaa Kaiserin ninhydriinimenetelmällä. Sitten Fmoc-AA x-AA 1 -hartsi pestään kerran DMF:llä ja sitten poistetaan suojaus emäksen liuoksella orgaanisessa liuottimessa, kuten piperidiinissä DMF:ssä, jolloin saadaan AA x -AA1 -hartsi. AAx-AA1-hartsi pestään sitten DMF:llä, minkä jälkeen pestään useita kertoja sekä alkoholilla, kuten MeOH:lla että DCM:llä. AAx-AA1-hartsi pestään sitten kerran DMF:llä noin 3 minuutin ajan, kolme kertaa isopropanolilla, edullisesti noin 2 minuutin ajan joka kerta, ja kolme kertaa DCM:llä, edullisesti noin 2 minuutin ajan joka kerta. Hartsi on sitten valmis joko Fmoc-suojatun aminohapon, kuten edellä on kuvattu, tai Boc-suojatun aminohapon, kuten alla on kuvattu.

Vastaavasti, jos mikä tahansa myöhempi aminohappo, joka kiinnitetään suojauksesta poistettuun AA1-hartsiin, valitaan suojatulla Boc-aminoryhmällä (Boc-AA x), joko suojausta ei tarvita sivuketjuryhmälle (tämä voi olla Boc-Gly , Boc-Ala, Boc-Phe tai Boc-Thr), tai sivuketju on suojattava ryhmällä, joka kestää sekä hapon että emäksen poistamista ja joka voi olla Boc-Cys(Acm). Jos Boc-AA x valitaan, se kiinnitetään käyttämällä samoja reagensseja ja liuottimia kuin edellä Fmoc-aminohapoille on kuvattu, ja kiinnityksen täydellisyys (täydellinen) voidaan tarkistaa Kaiserin ninhydriinimenetelmällä. Sen jälkeen Boc-AA x-AA1-hartsista poistetaan suojaus happoliuoksella orgaanisessa liuottimessa, kuten TFA:ssa DCM:ssä, jolloin saadaan CF3CO-H+-AA x-AA1-hartsi. Tämä hartsi pestään sitten useita kertoja klooratulla liuottimella, kuten DCM:llä, alkoholilla, kuten MeOH:lla, ja neutraloidaan ei-nukleofiilisellä emäksellä, kuten trietyyliamiinilla DCM:ssä, ja pestään sitten vielä useita kertoja klooratulla liuottimella, kuten DCM:llä, jolloin saadaan. AA x -AA 1 - hartsi. Hartsi on sitten valmis suojatun Boc- tai Fmoc-aminohapon lisäkiinnitykseen edellä kuvatulla tavalla.

Riippuen peptidin halutusta sekvenssistä ja käytetyn α-aminosuojatun aminohapon tyypistä (joko Fmoc-suojattu tai Boc-suojattu), käytetään yllä olevien kiinnitysmenetelmien sopivaa yhdistelmää sen mukaan, minkä aminohapon tulee tapahtua peptidisekvenssi-sivuketju, jossa on suojaava ryhmä, joka voidaan poistaa joko emäksellä, joka on tarpeen Fmoc:n poistamiseksi a-aminoryhmästä, tai hapolla, joka on tarpeen Boc:n poistamiseksi a-aminoryhmästä. Tällainen suojattu aminohappo voi olla N-p-Boc-N'-p-Fmoc-lysiini tai N-p-Fmoc-N'-p-Boc-lysiini. Jos näin on, kaikkien myöhempien aminohappojen a-aminoryhmien valikoitavissa olevien suojaryhmien N-terminaaliseen aminohappoon saakka on oltava yhteensopivia tälle asemalle valitun sivuryhmän suojauksen kanssa. Tämä tarkoittaa, että sivuketjua suojaavien ryhmien on oltava resistenttejä myöhempien aminohappojen a-aminoryhmien suojauksen poistamiseen käytetylle suojauksenpoistoaineelle. N-terminaalisen aminohapon osalta joko Boc:ta tai Fmoc:ta voidaan käyttää a-aminosuojana, koska N-terminaalisen aminohapon suojauksen poistaminen voi samanaikaisesti poistaa suojauksen joistakin suojatuista sivuketjuista vaikuttamatta ei-toivottavasti peptidisynteesistrategiaan, koska ei aminohappoja on enää saatavilla.

Valmis peptidiketju, joka on edelleen kiinnittynyt hartsiin, on poistettava suojauksesta ja vapautettava. Kaikkien emäsresistenttien suojaryhmien ja N-terminaalisen aminohapon a-aminoa estävän ryhmän poistamiseksi, mikäli mahdollista, hartsilla olevaa peptidiä käsitellään hapolla orgaanisessa liuottimessa, kuten TFA:ssa DCM:ssä. Mahdollisten happoresistenttien suojaryhmien ja N-terminaalisen aminohapon a-aminoa estävän ryhmän poistamiseksi, jos mahdollista, hartsilla olevaa peptidiä käsitellään orgaanisella emäksellä, kuten piperidiinillä DMF:ssä. Vaihtoehtoisesti happoresistentit ryhmät voidaan säilyttää, kunnes ne poistetaan peptidin myöhemmässä pilkkomisessa ammoniakilla tai amiiniemäksellä. Suojausvapautetulla hartsilla oleva peptidi pestään sitten klooratulla liuottimella, kuten DCM:llä, alkoholilla, kuten MeOH:lla ja kuivataan vakiopainoon alennetussa paineessa.

Peptidi katkaistaan ​​hartsista ja C-pää muutetaan amidiksi suspendoimalla peptidi hartsille 3:1 MeOH/DMF:ään. Liete jäähdytetään alle noin 10 °C lämpötilaan typpiatmosfäärissä ja vedetöntä ammoniakkikaasua johdetaan liuottimen pinnan alle, kunnes liuos on kyllästetty sillä, samalla kun lämpötila pidetään alle noin 10 °C. Lietettä sekoitetaan varovasti noin 24 tuntia samalla, kun lämpötilan annetaan nousta noin 20 °C:seen. Reaktion loppuunsaattamisaste tarkistetaan metyyliesterivälituotteen katoamisella HPLC:ssä sopivissa olosuhteissa peptidin tyypistä riippuen. reaktioseos jäähdytä ja lisää tarvittava määrä vedetöntä ammoniakkia, kunnes metyyliesteriä vastaava HPLC-piikin pinta-ala on alle 10 % kohdetuotteen piikin pinta-alasta. Liete jäähdytetään alle noin 10 °C:seen ja sekoitusta jatketaan yön yli peptidin saostamiseksi. Sakka ja hartsi erotetaan suodattamalla ja pestään kylmällä MeOH:lla. Sakka ja hartsi kuivataan alennetussa paineessa, tuote uutetaan hartsista etikkahapon vesiliuoksella.

Jos peptidi sisältää sekvenssissään suojattuja Cys-tähteitä, tioliryhmien suojaus voidaan poistaa ja tähteet syklisoida seuraavan menettelyn mukaisesti. Peptidi, joka sisältää Cys:n suojatut Asm-ryhmät, liuotetaan etikkahapon vesiliuokseen typpiatmosfäärissä. Liuosta sekoitetaan nopeasti ja jodin alkoholiliuos lisätään yhtenä annoksena. Seosta sekoitetaan ja suojauksen täydellinen poistaminen tarkistetaan HPLC:llä. Sitten reaktio pysäytetään titraamalla 2-prosenttisella natriumtiosulfaattiliuoksella, kunnes liuoksen väri häviää. Raaka seos puhdistettiin preparatiivisella kromatografialla C8-patruunalla asetonitriilin gradientilla 0,1 ammoniumasetaattipuskurissa, suolat poistettiin C8-patruunassa asetonitriilin gradientilla 0,25 N etikkahapossa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin kohdepeptidi.

Keksinnön esimerkinomainen suoritusmuoto

Seuraava esimerkki tarjotaan havainnollistamaan esillä olevan keksinnön menetelmää, eikä sitä tule pitää sen suoja-alaa rajoittavana.

Esimerkki 1. H2-D--Nal--Thr-NH2

A) Boc-L-Thr-hartsi

Liuos, jossa oli 2,58 g cesiumkarbonaattia 2,5 ml:ssa vettä, lisättiin hitaasti liuokseen, jossa oli 3,48 g Boc-L-treoniinia (Bachem California, Torrance, CA) liuotettuna 7 ml:aan metanolia. Saatua seosta sekoitettiin noin 1 tunti huoneenlämpötilassa, sitten kaikki metanoli ja kaikki vesi poistettiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin kuiva Boc-L-treoniinicesiumsuolajauhe. 10 g Maryfield-hartsia (kloorimetyloitu polystyreeni, 200-400 mesh, kloorin lisäys 1,3 meq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky) pestiin dikloorimetaanilla (DCM), metanolilla (MeOH) ja dimetyyliformamidilla (DMF) (kukin 70 2 kertaa). ml). Boc-L-treoniinicesiumsuolajauhe liuotettiin 60 ml:aan kuivaa DMF:a ja liuos yhdistettiin hartsin kanssa, joka pestiin kuten edellä. Lietettä sekoitettiin varovasti noin 50 - 60 °C:n lämpötilassa noin 85 - 90 tuntia typpiatmosfäärissä. Hartsi erotettiin suodattamalla ja pestiin perusteellisesti DMF:llä, deionisoidulla vedellä ja lopuksi MeOH:lla. Boc-treoniinihartsi kuivattiin alipaineessa noin 40 °C:ssa. Treoniinin sisällyttäminen oli 0,85 ± 0,15 mekv/g kuivaa hartsia.

B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-hartsi

2,0 g vaiheesta (A) saatua Boc-treoniinihartsia laitettiin 50 ml:n lasireaktoriin, jossa oli karkea sulatettu lasisuodatinpohja (kuorma 1,74 mmol). Hartsi pestiin 2 kertaa DCM:llä (20 ml), kullakin kerralla noin 5 minuuttia, suojaus poistettiin 25 % TFA:lla DCM:ssä (30 ml) - ensimmäisen kerran noin 2 minuuttia ja toisella kerralla noin 25 minuuttia, pestiin 3 kertaa noin 2 minuutin ajan DCM (20 ml), isopropanoli (20 ml) ja DCM (20 ml), neutraloitu kahdesti noin 5 minuutin ajan 10-prosenttisella trietyyliamiinilla DCM:ssä (20 ml), pestiin 3 kertaa noin 2 minuutin ajan DCM:llä ja pestiin kerran DMF:llä (20 ml) noin 5 minuutin ajan.

Hartsiin, josta suojaus oli poistettu, lisättiin 1,8 g (4,35 mmol, 2,5 ekv.) Fmoc-L-kysteiiniä (Acm) (Bachem, CA) ja 683 μl (4,35 mmol, 2,5 ekv.) di-isopropyylikarbodi-imidiä (DIC) 14:ssä ml 2:1 DCM/DMF noin 1 tunti, 2 min DXM (20 ml). Sitoutuminen tarkistettiin Kaiser-nihydriinimenetelmällä.

Kiinnittämisen jälkeen hartsi pestiin 1 kerran DMF:llä ja sitten suojaus poistettiin piperidiinin liuoksella DMF:ssä. Hartsi, josta suojaus oli poistettu, pestiin sitten DMF:llä ja pestiin useita kertoja samanaikaisesti MeOH:lla ja DCM:llä. Kytkentähartsi pestiin 1 kerran noin 3 minuuttia DMF:llä (20 ml), 3 kertaa noin 2 minuutin ajan isopropanolilla (20 ml) ja 3 kertaa DCM:llä (20 ml) noin 2 minuutin ajan kullakin kerralla. Sitoutuminen testattiin Kaiserin ninhydriinimenetelmällä.

Jokainen seuraavista suojatuista aminohapoista kiinnitettiin pestyyn hartsiin käyttämällä DIC:tä DMF/DCM:ssä ja vapautettiin edellä kuvatulla tavalla seuraavassa järjestyksessä: Fmoc-L-valiini, Fmoc-L-lysiini (Boc), Fmoc-D-tryptofaani, Fmoc-L-tyrosiini (O-t-Bu) ja Fmoc-L-kysteiini (Acm) (kaikki Bachem Californialta), Boc-D-2-naftyylialaniini (Synthethech, Albany, OR).

Valmis peptidiketju poistettiin ja suojattiin kahdesti 75:20:5 DCM/TFA/anisolilla (30 ml) noin 2 minuuttia ja noin 25 minuuttia, pestiin 3 kertaa noin 2 minuuttia joka kerta DCM:llä (20 ml), isopropanolilla. (10 ml) ja DCM (20 ml), neutraloitiin 2 kertaa noin 5 minuutin ajan 10-prosenttisella trietyyliamiinilla DCM:ssä (20 ml) ja pestiin 3 kertaa noin 2 minuutin ajan DCM:llä (20 ml) ja MeOH:lla (20 ml). Hartsi kuivattiin alipaineessa. Kuivapaino oli 3,91 g (103 % teoreettisesta saannosta).

B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2

2,93 g peptidillä ladattua hartsia vaiheesta (B) (1,3 mmol-ekv.) suspendoitiin 50 ml:aan 3:1 MeOH/DMF-seosta. Liete jäähdytettiin alle noin 10 °C:n lämpötilaan typpiatmosfäärissä ja kuivaa ammoniakkikaasua huuhdeltiin, kunnes liuos oli kyllästetty sillä, samalla kun lämpötila pidettiin alle noin 10 °C:ssa. Lietettä sekoitettiin varovasti noin 24 tuntia, jolloin lämpötilan annettiin nousta noin 20 °C:seen. Reaktion valmistumisaste tarkistettiin metyyliesterivälituotteen häviämisellä käyttämällä HPLC:tä (VYDAC® sorbentti, raekoko 5 μm, huokoskoko 100 Å, C18, eluointi isokraattisissa olosuhteissa 26 % CH 3 CN 0,1 % TFA:ssa, nopeus 1 ml/min, tallennus 220 mm; näissä olosuhteissa hidastusaika Rt ~ 14 min metyyliesterille ja ~ 9,3 min amidituotteelle). Reaktioseos jäähdytettiin ja lisättiin ylimäärä vedetöntä ammoniakkia, kunnes metyyliesteriä vastaava piikin pinta-ala HPLC:llä oli alle 10 % halutun tuotteen piikin pinta-alasta. Liete jäähdytettiin lämpötilaan alle noin 10 °C, sekoitusta jatkettiin yön yli peptidin saostamiseksi. Sakka ja hartsi erotettiin suodattamalla ja pestiin 15 ml:lla kylmää MeOH:ta. Sakka ja hartsi kuivattiin alipaineessa, tuote uutettiin hartsista 50-prosenttisella etikkahapon vesiliuoksella (3 x 30 ml). HPLC-analyysi osoitti 870 mg (0,70 mmol) otsikon tuotetta seoksessa (96 % puhdas isokraattisessa HPLC-järjestelmässä).

D) H-D--Nal--Thr-NH2

500 mg (0,40 mmol) vaiheen (B) peptidiä liuotettiin 300 ml:aan 4-prosenttista etikkahappoa ja kuumennettiin noin 55 °C:seen typen alla. Liuosta sekoitettiin nopeasti ja 2 % w/v jodin liuos 7,7 ml:ssa MeOH:ta (0,60 mmol) lisättiin yhtenä annoksena. Seosta sekoitettiin noin 15 minuuttia, sitten reaktio pysäytettiin titraamalla 2-prosenttisella natriumtiosulfaattiliuoksella, kunnes väri hävisi (-2 ml). Seos jäähdytettiin lämpötilaan huonelämpötila ja suodatetaan. Seos puhdistettiin preparatiivisella kromatografialla C8-kolonnissa (YMC, Inc., Wilmington, NC) asetonitriilin gradientilla 0,1 M ammoniumasetaatissa, suolat poistettiin C8 YMC -pylväässä asetonitriilin gradientilla 0,25 N etikkahapossa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 350 mg kohdepeptidiä 99 %:n puhtaudella.

Yllä olevan kuvauksen perusteella alan ammattilainen voi helposti tunnistaa esillä olevan keksinnön olennaiset piirteet ja sen hengestä ja laajuudesta poikkeamatta tehdä keksintöön erilaisia ​​muutoksia ja modifikaatioita mukauttaakseen sitä erilaisiin sovelluksiin ja olosuhteisiin. Siten myös muut keksinnön suoritusmuodot kuuluvat patenttivaatimusten piiriin.

VAATIMUS

1. Menetelmä kaavan H-D--Nal--Thr-NH2 mukaisen peptidin valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää seuraavat vaiheet:

(a) kiinnitetään ensimmäinen aminohappo kiinteään kantajahartsiin eetterisidoksella "ensimmäisen kytkentätuotteen" muodostamiseksi, joka sisältää (i) cesiumkarbonaatin vesiliuoksen saattamisen reagoimaan ensimmäisen aminohapon alkoholiliuoksen kanssa ensimmäisen aminohapon cesiumsuola, (ii) ensimmäisen aminohapon liuotinvapaan cesiumsuolan saaminen, (iii) kiinteän kantajahartsin saattaminen reagoimaan ensimmäisen aminohapon cesiumsuolan kanssa vedettömässä polaarisessa aproottisessa liuottimessa "ensimmäinen lisäystuote",

jossa ensimmäinen aminohappo on Boc-L-Thr, joka vastaa tämän peptidin C-terminaalista aminohappoa, ja kiinteä väliainehartsi on kloorimetyloidun polystyreenin hartsi;

(b) poistetaan Boc:n suojaus ensimmäisestä additiotuotteesta hapolla, jolloin muodostuu "ensimmäinen lisäystuote, josta suojaus on poistettu";

(c) Valinnaisesti "seuraavan aminohapon" lisääminen "suojauksesta poistettuun ensimmäiseen kiinnittymistuotteeseen" "seuraava aminohappo", joka sisältää "seuraavan aminohapon" reagoimisen "ensimmäisen kiinnittymisen tuotteen" kanssa orgaanisessa liuottimessa, joka sisältää peptidikasvatusreagenssin, jotta saadaan "estetty seuraava aminohappotuote". lisäys" ja "seuraavassa aminohapossa" on Boc:n estämä aminoryhmä pääketjussa, ja jos tämän "seuraavan aminohapon" sivuketjussa on yksi tai useampi funktionaalinen ryhmä, sivuketjun funktionaaliset ryhmät eivät vaadi suojausta tai näissä sivuketjun funktionaalisissa ryhmissä on suojaryhmiä, jotka ovat stabiileja happamille tai emäksisille suojauksenpoistoaineille, vastaavasti, Boc ja Fmoc;

(d) Boc:n suojauksen poistaminen "seuraavalta tuotteelta", joka sisältää "estetyn seuraavan tuotteen" saattamisen reagoimaan hapon kanssa "seuraavan tuotteen, josta suojaus on poistettu" saamiseksi;

(e) valinnaisesti toistetaan vaiheet (c) ja (d), jolloin jokainen sykli tuottaa "seuraavan (X+1):nnen kiinnityksen eston poistetun tuotteen", jossa X on haluttujen syklin toistojen lukumäärä;

(e) "seuraavan aminohapon" lisääminen vaiheen (b) "suojatun ensimmäisen linkin tuotteeseen" tai valinnaisesti "seuraavan linkin (X+1) deblokoituun tuotteeseen" vaiheesta (e), joka sisältää reaktion "seuraava aminohappo" suorittamisen määritellyn "ensimmäisen kiinnittymisen tuotteen, josta suojaus on poistettu" tai määritellyn "seuraavan (X + 1):nnen kiinnityksen tuotteen, josta suojaus on poistettu" kanssa orgaanisessa liuottimessa, joka sisältää reagenssin peptidin kasvattamiseksi jotta saadaan "estetty seuraava kiinnitystuote", ja tässä "seuraavassa aminohapossa" on Fmoc-suojattu pääketjun aminoryhmä edellyttäen, että jos "seuraavassa aminohapossa" on yksi tai useampi funktionaalinen ryhmä sivuketjussa, niin funktionaaliset ryhmät sivuketjussa eivät vaadi suojausta tai sivuketjun funktionaalisissa ryhmissä on suojaryhmiä, jotka ovat resistenttejä emäksisille reagensseille, joita käytetään Fmoc:n suojauksen poistamiseen;

(g) "suojatun seuraavan tuotteen" Fmoc:n suojauksen poistaminen, joka sisältää "estetyn seuraavan tuotteen" saattamisen reagoimaan primäärisen tai sekundaarisen amiinin kanssa "seuraavan tuotteen, josta suojaus on poistettu" saamiseksi;

(h) valinnaisesti vaiheiden (e) ja (g) toistaminen, jolloin jokainen sykli tuottaa "seuraavan (X+1):nnen liitteen eston poistetun tuotteen", jossa X on haluttu syklin toistojen lukumäärä, kunnes ne sisällytetään peptidi ja toiseksi viimeinen aminohappo vapautuu;

(i) N-terminaalisen aminohapon lisääminen "seuraavan (X+1)-liittymän suojauksesta poistettuun tuotteeseen", joka sisältää N-terminaalisen aminohapon saamisen reagoimaan "seuraavan (X+1)-suojauksen poistetun tuotteen kanssa" liittyminen" orgaanisessa liuottimessa, joka sisältää reagenssin peptidin pidentämiseksi "estetyn täydellisen kiinnittymistuotteen" muodostamiseksi, jolloin "N-terminaalisella aminohapolla" on rungon aminoryhmä, jonka Boc tai Fmoc estää;

(j) Boc:n tai Fmoc:n suojauksen poistaminen "suljetusta valmiista tuotteesta" käsittäen "estetty valmiin tuotteen" saattamisen reagoimaan hapon kanssa Boc:n tapauksessa tai emäksen kanssa Fmoc:n tapauksessa valmiin peptidituotteen muodostamiseksi hartsille;

(j) jos "hartsipäätteisessä peptidituotteessa" on sivuketjun funktionaalisia ryhmiä, sitten mahdollisesti suojauksen poistaminen "hartsipäätteisen peptidituotteen" sivuketjun funktionaalisista ryhmistä, mikä sisältää "hartsipäätteisen peptidituotteen" saattamisen reagoimaan sopivien suojauksenpoistoreagenssien kanssa valmistaa "täydellinen peptidituote hartsille, josta suojaus on poistettu"; Ja

(k) peptidin lohkaiseminen "valmiin peptidituotteen hartsilla" tai "lopullisen peptidituotteen hartsilla, josta suojaus on poistettu" kiinteästä hartsikantajasta, jolloin saadaan peptidi, joka käsittää "hartsilla olevan valmiin peptidituotteen" tai "valmiin peptidituotteen hartsilla" saattamisen reagoimaan. hartsi"; suojattu hartsi" ammoniakilla, primäärisellä amiinilla tai sekundaarisella amiinilla, kunnes peptidin pilkkoutuminen hartsista on lähes täydellinen;

edellyttäen, että peptidin synteesin vaiheet (e) ja (g) suoritetaan kuusi kertaa kaavan H-L-Thr-hartsin "ensimmäisen kiinnittymisen tuotteen, josta suojaus on poistettu" muodostumisen jälkeen, jolloin seuraavat aminohapot kiinnittyvät järjestys: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) ja Fmoc-L-Cys( Acm) H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-hartsin muodostamiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ammoniakki, primaarinen amiini tai sekundaarinen amiini vaiheessa (k) on liuottimessa, joka sisältää alkoholia ja mahdollisesti aproottista polaarista liuotinta.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe (l) käsittää lisäksi seuraavat vaiheet:

(i) saostetaan pilkottu peptidi liuottimesta;

(ii) suodatetaan pois kiinteä hartsikantaja ja saostunut peptidi, ja

(iii) uutetaan peptidi happamalla liuoksella peptidin eristämiseksi.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen aminohappo on Boc-L-Thr:n cesiumsuola, jolloin saadaan Boc-L-Thr-hartsi ensimmäisenä kytkentätuotteena ja "suojattu ensimmäinen kytkentätuote. "on H-L-Thr -hartsi.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Boc-suojaryhmän poistamiseen vaiheessa (i) käytetty happo on trifluorietikkahappo (TFA).

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että orgaaninen liuotin on metyleenikloridi, kloroformi tai dimetyyliformamidi ja peptidin kasvatusreagenssi on di-isopropyylikarbodi-imidi, disykloheksyylikarbodi-imidi tai N-etyyli-N"-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, joka käsittää Boc-D--Nal:n liittämisen H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-hartsiin. vaiheen (i) mukaisesti Boc-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-hartsin saamiseksi.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Boc-D-Nal-Cys(Acm)-:sta poistetaan samanaikaisesti D--Nal:ia estävä Boc-ryhmä, Tyr:ää suojaava O-t-Bu-ryhmä ja Lys-ryhmää suojaava Boc-ryhmä. Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-hartsi, vaiheen (d) mukaisesti valmiin peptidituotteen saamiseksi kaavan H-D--Nal-Cys mukaiselle hartsille (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-hartsi.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr lohkaistaan ​​kiinteästä hartsista suorittamalla reaktio H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-hartsi ammoniakin kanssa liuottimessa, joka sisältää alkoholia ja valinnaisesti aproottista polaarista liuotinta, kunnes eliminaatio on oleellisesti täydellinen, jolloin saadaan H-D--Nal -Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alkoholi on metanoli ja polaarinen aproottinen liuotin on dimetyyliformamidi.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että poistetaan samanaikaisesti Cys:tä suojaavat Acm-ryhmät ja syklisoidaan tuloksena olevat suojaukset poistaneet Cys-tähteet "hartsilla olevasta täydellisestä peptidituotteesta", jonka kaava on H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D. -Trp- Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 suorittamalla H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH:n reaktio 2 jodin alkoholiliuoksella suojauksen poistamisen ja syklisoinnin oleellisesti loppuun saattamiseksi, jolloin saadaan H-D--Nal--Thr-NH2.