Sinteza u čvrstoj fazi. Struktura peptida. Reakcije stvaranja peptidne veze
Kombinatorna sinteza se može izvesti ne samo u rastvoru (sinteza u tečnoj fazi), već i na površini čvrste hemijski inertne faze. U ovom slučaju, prvi polazni materijal se hemijski „ušije“ za funkcionalne grupe na površini polimernog nosača (najčešće se koristi esterska ili amidna veza) i tretira rastvorom drugog polaznog materijala koji se uzima u značajan višak tako da reakcija ide do kraja. Postoji određena pogodnost u ovom obliku reakcije, jer je tehnika izolacije proizvoda olakšana: polimer (obično u obliku granula) se jednostavno odfiltrira, temeljito ispere od ostataka drugog reagensa, a ciljno jedinjenje se hemijski odcijepljen od njega.
U organskoj hemiji ni u jednom slučaju ne postoji niti jedna reakcija koja u praksi daje kvantitativne prinose ciljnih proizvoda. Jedini izuzetak čini se da je potpuno sagorijevanje organskih tvari u kisiku na visoke temperature na CO 2 i H 2 O. Stoga je prečišćavanje ciljnog proizvoda uvijek neizostavan, a često i najteži i dugotrajan zadatak. Posebno težak zadatak je izolacija proizvoda sinteze peptida, na primjer, odvajanje složene mješavine polipeptida. Stoga je u sintezi peptida najširu primijenjena metoda sinteze na čvrstom polimernom supstratu, koju je ranih 1960-ih razvio R. B. Merifield.
Polimerni nosač u Merrifield metodi je granulirani umreženi polistiren koji sadrži klorometil grupe u benzenskim prstenovima, koji su linkeri koji vezuju nosač za prvi aminokiselinski ostatak polipeptida. Ove grupe transformišu polimer u funkcionalni analog benzil hlorida i daju mu sposobnost da lako formira esterske veze nakon reakcije sa karboksilatnim anionima. Kondenzacija takve smole sa N-zaštićenim amino kiselinama dovodi do stvaranja odgovarajućih benzil estera. Uklanjanje N-zaštite sa daje C-zaštićeni derivat prve aminokiseline kovalentno vezan za polimer. Aminoacilacija oslobođene amino grupe sa N-zaštićenim derivatom druge amino kiseline, nakon čega slijedi uklanjanje N-zaštite, rezultira sličnim dipeptidnim derivatom koji je također vezan za polimer:
Takav dvostepeni ciklus (deprotekcija - aminoacilacija) se u principu može ponoviti onoliko puta koliko je potrebno da se izgradi polipeptidni lanac zadate dužine.
Dalji razvoj Merifieldovih ideja bio je prvenstveno usmjeren na pronalaženje i stvaranje novog polimernih materijala za supstrate, razvoj metoda za odvajanje proizvoda i stvaranje automatizovanih postrojenja za ceo ciklus sinteze polipeptida
Efikasnost Merifield metode je dokazana uspješnom sintezom niza prirodnih polipeptida, posebno inzulina. Posebno jasno su se njegove prednosti pokazale na primjeru sinteze enzima ribonukleaze. Tako su, na primjer, po cijenu značajnih napora, tokom nekoliko godina, Hirschman i 22 zaposlena izvršili sintezu enzima ribonukleaze (124 aminokiselinska ostatka) tradicionalnim metodama tekuće faze. Gotovo istovremeno, isti protein je dobijen automatiziranom sintezom u čvrstoj fazi. U drugom slučaju, sinteza, koja uključuje ukupno 11.931 različite operacije, uključujući 369 hemijske reakcije, završila su dva učesnika (Gatte i Merrifield) za samo nekoliko mjeseci.
Merrifieldove ideje poslužile su kao osnova za stvaranje razne metode kombinatorna sinteza biblioteka polipeptida različitih struktura.
Tako je 1982. godine predložena originalna strategija za višestepenu paralelnu sintezu peptida na čvrstoj fazi, poznata kao “split metoda” ( podijeliti- cijepanje, razdvajanje) ili metodom “mix and split” (slika 3). Njegova suština je sljedeća. Recimo da od tri aminokiseline (A, B i C) trebate dobiti sve moguće kombinacije tripeptida. Za to se granule čvrstog polimernog nosača (P) dijele na tri jednaka dijela i tretiraju otopinom jedne od aminokiselina. U ovom slučaju, sve aminokiseline su hemijski vezane za površinu polimera pomoću jedne od svojih funkcionalnih grupa. Dobijeni polimeri tri stepena se dobro izmešaju, a smeša se ponovo podeli na tri dela. Zatim se svaki dio, koji sadrži sve tri aminokiseline u jednakim količinama, ponovo tretira jednom od iste tri aminokiseline i dobije se devet dipeptida (tri mješavine po tri proizvoda). Još jedno miješanje, podjela na tri jednaka dijela i tretman aminokiselinama daje željenih 27 tripeptida (tri mješavine po devet proizvoda) u samo devet faza, dok bi njihovo zasebno dobivanje zahtijevalo sintezu od 27 × 3 = 81 faza.
Čvrstofazna sinteza ili tehnologija čvrste faze, koja se često naziva i keramika, najčešća je u proizvodnji neorganskih materijala za različite grane nauke i industrije. To uključuje nuklearno gorivo, materijale za svemirsku tehnologiju, radio elektroniku, instrumentaciju, katalizatore, vatrostalne materijale, visokotemperaturne supravodiče, poluvodiče, fero- i piezoelektrike, magnete, razne kompozite i mnoge druge.
Sinteza u čvrstoj fazi zasniva se na hemijskim reakcijama u kojima je najmanje jedan od reaktanata u obliku čvrste supstance. Takve reakcije se nazivaju heterogene ili čvrste faze. Interakcija čvrste faze, za razliku od reakcija u tečnom ili gasovitom mediju, sastoji se od dva osnovna procesa: od same hemijske reakcije i prenosa materije u reakcionu zonu.
Reakcije u čvrstom stanju koje uključuju kristalne komponente karakteriziraju ograničena pokretljivost njihovih atoma ili jona i složena ovisnost o mnogim faktorima. To uključuje hemijsku strukturu i pridruženu reaktivnost reagujućih čvrstih materija, prirodu i koncentraciju defekata, stanje površine i morfologiju reakcione zone, kontaktnu površinu reagensa u interakciji, preliminarnu mehanohemijsku aktivaciju i niz drugi. Sve navedeno određuje složenost mehanizama heterogenih reakcija. Proučavanje heterogenih reakcija zasniva se na hemiji čvrstog stanja, hemijskoj fizici i fizičkoj hemiji površine čvrstih tela, na zakonima termodinamike i kinetike.
Često se o mehanizmu reakcija u čvrstom stanju sudi samo na osnovu toga da se eksperimentalni podaci o stepenu interakcije kao funkciji vremena najbolje opisuju bilo kojim posebnim kinetičkim modelom i odgovarajućom kinetičkom jednadžbom. Ovakav pristup može dovesti do pogrešnih zaključaka.
Procesi u materijalima u čvrstom stanju imaju niz važnih razlika od procesa u tekućinama ili plinovima. Ove razlike su povezane, prije svega, sa značajno (za nekoliko redova veličine) nižom brzinom difuzije u čvrstim tvarima, što onemogućava usrednjavanje koncentracije komponenti u sistemu i samim tim dovodi do prostorne lokalizacije procesa koji se dešavaju. Prostorna lokalizacija, zauzvrat, dovodi do činjenice da i specifična brzina procesa (ili koeficijent difuzije) i geometrija reakcione zone doprinose uočenoj kinetici procesa. Takve karakteristike procesa u čvrstoj fazi određene geometrijskim faktorima nazivaju se topohemijskim. Osim toga, budući da su transformacije o kojima se raspravlja prostorno lokalizirane, njihova brzina može biti određena i samim procesima na granici faze (kontrola reakcije) i brzinom dovoda bilo koje komponente na ovo sučelje ili uklanjanjem proizvoda ( s) (kontrola difuzije). Ovi slučajevi za jednostavne sisteme, za koje su pretpostavke modela zadovoljene, mogu se eksperimentalno identifikovati oblikom vremenske zavisnosti stepena konverzije. Još jedna karakteristika faznih transformacija u čvrstim tijelima povezana je s činjenicom da formiranje novog faznog jezgra u čvrstoj matrici uzrokuje pojavu elastičnih naprezanja u potonjoj, čija se energija u nekim slučajevima mora uzeti u obzir pri razmatranju termodinamike. ovih transformacija.
Veliki broj faktora koji utiču na kinetiku procesa u čvrstoj fazi i na mikrostrukturu tako dobijenih materijala takođe determiniše mnogostrukost tipova klasifikacije ovih procesa. Dakle, s obzirom na stabilnost sistema u odnosu na fluktuacije različitih tipova, heterogene (u slučaju sistema koji su stabilni na male fluktuacije u zauzetoj zapremini i nestabilni na velike) i homogene (u slučaju sistema koji su nestabilni). do malih fluktuacija) razlikuju se procesi. Za heterogene procese, kao primjer, mogu se navesti transformacije koje se odvijaju prema mehanizmu nastanka i rasta jezgara, za homogene procese neki prijelazi red-poremećaj i spinodalna dekompozicija čvrstih otopina.
Potrebno je razlikovati heterogenu i homogenu nukleaciju od heterogenih i homogenih procesa u slučaju heterogenih procesa. Heterogena nukleacija se odnosi na formiranje jezgara na strukturnim defektima (uključujući tačkaste defekte, dislokacije i granice faza); homogena nukleacija - formiranje jezgara u volumenu čvrste faze bez defekata.
Analizirajući proizvod transformacije čvrste faze, razlikuje se jednofazna i višefazna jezgra. U slučaju višefaznih jezgara, proizvod procesa je višefazna kolonija sa karakterističnom mikrostrukturom određenom površinskom energijom granice formiranih faza; procesi ovog tipa nazivaju se diskontinuiranim, za razliku od kontinuiranih procesa u slučaju stvaranja i rasta jednofaznih jezgara.
Drugi način klasifikacije transformacija čvrste faze zasniva se na poređenju sastava početne faze i sastava produkta reakcije. Ako se poklapaju, govore o procesima bez difuzije, a ako se sastav mijenja, govore o difuziji. Štaviše, korisno je razlikovati od nedifuzijskih procesa kooperativne procese (na primjer, martenzitna transformacija) koji se javljaju uz pomoć istovremenog blagog pomjeranja atoma u velikom volumenu početne faze.
Fazne transformacije bez difuzije mogu se razlikovati po vrsti svojih termodinamičkih karakteristika koje se mijenjaju tokom procesa.
Transformacije prve vrste su procesi u kojima dolazi do promjene derivata hemijskog potencijala u odnosu na temperaturu ili pritisak. To implicira naglu promjenu tokom fazne tranzicije termodinamičkih parametara kao što su entropija, zapremina, entalpija i unutrašnja energija. Prilikom transformacija druge vrste, prvi derivati hemijskog potencijala u odnosu na intenzivne parametre se ne menjaju, ali se menjaju derivati višeg reda (počev od drugog). U ovim procesima, uz kontinuiranu entropiju i zapreminu sistema, dolazi do nagle promene u količinama izraženim drugim derivatima Gibsove energije: toplotni kapacitet, koeficijent toplotnog širenja, kompresibilnost itd.
Reakcije čvrste faze između dvije faze (kontakti između tri ili više faza su malo vjerojatni, a odgovarajući procesi se mogu predstaviti kao kombinacije nekoliko dvofaznih reakcija) su difuzijski procesi i mogu biti heterogene ili homogene, s heterogenom i homogenom nukleacijom . Homogeni procesi i procesi sa homogenom nukleacijom u takvim reakcijama mogući su, na primjer, u slučaju stvaranja metastabilne čvrste otopine s naknadnom razgradnjom (tzv. unutrašnje reakcije). Primjer takvih procesa može biti unutrašnja oksidacija.
Uslov za termodinamičku ravnotežu u transformaciji čvrstog stanja, kao iu svakoj drugoj hemijskoj transformaciji, je jednakost hemijskih potencijala komponenti u polaznim materijalima i produktima reakcije. U interakciji dvije čvrste faze može se ostvariti naznačena jednakost hemijskih potencijala Različiti putevi: 1) preraspodela komponenti u početnim fazama sa formiranjem čvrstih rastvora; 2) formiranje novih faza sa drugačijom kristalnom strukturom (što se, zapravo, obično naziva reakcija čvrste faze), a budući da hemijski potencijal komponente u različitim fazama višefaznog sistema ne zavisi od količine u svakoj fazi, ravnoteža se može postići samo kada potpuna transformacija početne faze. Najpouzdanije informacije o mehanizmu reakcija u čvrstoj fazi dobijaju se kompleksnom upotrebom, što omogućava istovremeno posmatranje nekoliko parametara reakcionog sistema, uključujući fazni sastav, toplotne efekte, promene mase i drugo.
Termodinamičku teoriju reakcija čvrstog stanja predložio je Wagner, a dalje je razvio Schmalzried na primjeru reakcija adicije.
Do danas ne postoji jedinstvena klasifikacija širokog spektra heterogenih reakcija. To je zbog poteškoća u odabiru kriterija kao osnove za takvu univerzalnu klasifikaciju. Prema hemijskim kriterijumima, reakcije se dele na reakcije oksidacije, redukcije, razgradnje, kombinacije, razmene itd. Uz navedeni kriterijum, široko se koristi kao glavni kriterijum za fizičko stanje reagensa:
Karakteristična karakteristika svih heterogenih reakcija je postojanje i lokalizacija na granici faze reakcijske zone. Reakciona zona, po pravilu, male debljine razdvaja dva područja prostora koji zauzimaju supstance različitog sastava i sa razna svojstva. Razlozi za nastanak reakcione zone obično se dijele u dvije grupe: relativna sporost procesa difuzije i hemijski razlozi. Posljednja grupa nastaje zbog visoke reaktivnosti atoma ili molekula smještenih na površini čvrstog reagensa ili na granici između dvije postojeće faze. Poznato je da površina čvrste ili tekuće tvari ima svojstva koja se razlikuju od zapreminskih svojstava kompaktnog uzorka. Ovo čini svojstva interfejsa specifičnima. Ovdje se događa značajno preuređenje kristalnog pakiranja, smanjuju se naponi između dvije kristalne rešetke i mijenja se kemijski sastav.
Budući da se prijenos mase odvija difuzijom, a difuzijska pokretljivost čvrstih čestica ovisi o defektnosti njihove strukture, može se očekivati značajan utjecaj defekata na mehanizam i kinetiku reakcija u čvrstoj fazi. Ova faza prethodi hemijskoj fazi transformacije reaktanata na međufaznoj granici. Dakle, kinetika heterogenih reakcija određena je kako prirodom toka same kemijske reakcije, tako i metodom isporuke tvari u reakcijsku zonu. U skladu sa gore navedenim, brzina reakcija će biti ograničena hemijskim stadijem (hemijska kinetika) ili difuzijom (kinetika difuzije). Takav fenomen se uočava u stvarnosti.
Prema Wagneru, difuzija i, posljedično, reakcija u čvrstim tvarima odvija se uglavnom zbog pokretljivosti iona i elektrona, zbog neravnotežnog stanja rešetke. Različiti ioni rešetke kreću se u njemu različitim brzinama. Konkretno, pokretljivost anjona u velikoj većini slučajeva je zanemarljiva u odnosu na pokretljivost kationa. Stoga se difuzija i, prema tome, reakcija u čvrstim tvarima odvija zbog kretanja kationa. U ovom slučaju, difuzija različitih katjona može ići u istom smjeru ili jedan prema drugom. U slučaju različito nabijenih katjona, elektroneutralnost sistema je očuvana zbog kretanja elektrona. Zbog razlike u brzinama kretanja različito nabijenih katjona, u sistemu nastaje električni potencijal. Kao rezultat toga, brzina kretanja mobilnijih jona se smanjuje i, obrnuto, za manje mobilnih? povećava. Dakle, rezultujući električni potencijal reguliše stope difuzije jona. Potonji i njime određena brzina cjelokupnog procesa transformacije čvrstog stanja mogu se izračunati na osnovu elektronske provodljivosti i prijenosnih brojeva. Očigledno je da je usmjerena difuzija iona moguća samo u električno polje ili ako postoji gradijent koncentracije u sistemu.
U sintezi supstanci u čvrstom stanju često je potrebno kontrolisati ne samo hemijski (elementarni i fazni) sastav nastalog proizvoda, već i njegovu mikrostrukturnu organizaciju. To je zbog jake ovisnosti i kemijskih (na primjer, aktivnost u reakcijama u čvrstoj fazi) i mnogih fizičkih (magnetskih, električnih, optičkih, itd.) svojstava o karakteristikama strukturne organizacije čvrste tvari na različitim hijerarhijskim razinama. Prvi od ovih nivoa uključuje elementarni sastav čvrste materije i metodu međusobnog rasporeda atoma elemenata u prostoru - kristalnu strukturu (ili karakteristike najbližeg koordinacionog okruženja atoma u amorfnim čvrstim materijama), kao i sastav i koncentracija tačkastih defekata. Kao sljedeći nivo strukture čvrstog tijela možemo smatrati raspodjelu proširenih defekata u kristalu, koja određuje veličine područja u kojima se (ispravljeno zbog postojanja točkastih defekata) opaža translacijska simetrija u rasporedu atoma. . Takva područja se mogu smatrati savršenim mikrokristalima i nazivaju se područjima koherentnog raspršenja. Govoreći o područjima koherentnog raspršenja, mora se imati na umu da, u općem slučaju, oni nisu ekvivalentni kompaktnim česticama koje formiraju čvrsti materijal, koji može sadržavati značajan broj proširenih defekata, a samim tim i područja koherentne rasipanje. Podudarnost područja koherentnog raspršenja sa česticama (koje se u ovom slučaju nazivaju jednodomenskim) obično se opaža samo za dovoljno male (manje od 100 nm) veličine potonjih. Naknadni strukturni nivoi mogu biti povezani sa distribucijom oblika i veličine čestica koje formiraju prah ili keramički materijal, njihovom agregacijom, agregacijom primarnih agregata itd.
Različite primjene materijala čvrste faze imaju različite, često suprotstavljene zahtjeve za strukturne karakteristike koje su gore navedene i stoga zahtijevaju različite sintetičke metode. Stoga je ispravnije govoriti o metodama sinteze ne tvari u čvrstoj fazi, već materijala čvrste faze i, u svakom slučaju, odabrati metodu sinteze uzimajući u obzir područje naknadne primjene dobivenog proizvoda.
U opštem slučaju, metode za sintezu čvrstofaznih materijala mogu se klasifikovati prema njihovoj udaljenosti od termodinamički ravnotežnih uslova za tok hemijskih procesa koji se koriste. U skladu sa opštim zakonima, pod uslovima koji odgovaraju stanju što je moguće daljem od ravnoteže, primećuje se značajan višak brzine nukleacije u odnosu na brzinu rasta formiranih jezgara, što očigledno dovodi do dobijanja najraspršenijeg proizvoda. U slučaju izvođenja procesa u blizini termodinamičke ravnoteže, rast već formiranih jezgri odvija se brže od stvaranja novih, što zauzvrat omogućuje dobivanje krupnozrnih (u krajnjem slučaju, monokristalnih) materijala. Brzina rasta kristala je također u velikoj mjeri određena koncentracijom proširenih (neravnotežnih) defekata u njima.
Sinteza u čvrstoj fazi zasniva se na činjenici da je prva karika budućeg oligomera kovalentno vezana za "sidrenu" grupu H., produžetak lanca se provodi standardnim zaštićenim monomerima prema uobičajenim shemama koje se koriste za sintezu u otopinama. Zaključiti. faza sinteze. oligomer se odvaja od N. i prečišćava odgovarajućim metodama. Uglavnom se koristi sinteza na čvrstoj fazi. za dobijanje polipeptida, oligonukleotida i oligosaharida.
Tokom sinteze polipeptida kao N. naib. kopolimer stirena i 1-2% divinilbenzena se široko koristi, modificiran uvođenjem sidrene grupe dimetoksibenzil klorida za pričvršćivanje prve amino kiseline (sa zaštićenom N H 2 grupom) na C-terminusu, na primjer:
Nakon uklanjanja N-zaštitne grupe, produžetak polipeptidnog lanca se vrši standardnim metodama sinteze peptida u rastvoru (vidi Peptidi). Kao kondenzatori, Naib. često se koriste karbodiimidi ili se aminokiseline preliminarno pretvaraju u aktivator. eteri.
U sintezi oligonukleotida kao nukleinske kiseline koriste se makroporozna stakla ili silika gel. Sidrena grupa je karboksilna grupa, odvojena od N. spec. "noga", na primjer:
B-purinska ili pirimidna baza
U prvoj fazi, nukleozid je vezan za nosač na 3 "-hidroksilnoj grupi deoksiriboze, u kojoj je hidroksilna grupa na poziciji 5" zaštićena dimetoksitritil grupom (CH 3 OS 6 H 4) 2 (C 6 H 5) C (DMTr ); količina potonjeg nakon odvajanja lako se mjeri spektrofotometrijski, što služi kao veličina. karakterističan za punjenje nosača i omogućava vam da procenite prinose u narednim fazama izgradnje oligonukleotidnog lanca. Nakon uklanjanja DMTr grupe, lanac se sklapa pomoću fosfitamida (fl. I; M. Kaposers, 1980) ili fosfonata (hidrofosfonata) (II; R. Stremberg, 1986):
Za sprovođenje sinteze u čvrstoj fazi potrebni su visoki prinosi (na nivou od 96-99%) u svakoj fazi okruga, kao i efikasne metode prečišćavanje i izolacija sintetiziranog. veze.
Upotreba čvrste faze omogućava značajno pojednostavljenje i ubrzanje svake faze rasta lanca oligomera, jer se odvajanje viška komponenti, kondenzatora i nusproizvoda u otopini postiže filtriranjem reakcija. mješavine i ispiranje N. odgovarajućim setom rastvora. Stoga se proces sklapanja oligomernog lanca razlaže na nekoliko standardnih operacija: deblokiranje rastućeg kraja lanca, doziranje sljedećeg zaštićenog monomera i kondenzirajućeg agensa, punjenje ove smjese u N. kolonu za izračunato vrijeme i pranje ispraznite N. odgovarajućim rastvaračem. Ciklus izgradnje monomerne veze m. b. automatizovano.
U srcu automatike matursko veče. sintisajzeri su uobičajeni dijagram strujnog kola(vidi sl.). Brojne Modeli sintisajzera razlikuju se po dizajnu kolona i njihovom broju, načinu snabdijevanja reagensima i rastvaračima itd. Kontrola i programiranje se vrši pomoću ugrađenog ili udaljenog računala.
Šematski dijagram automatskog uređaja. matursko veče. sintisajzeri (električna kontrolna linija je označena isprekidanom linijom): 1 - linija za dovod monomera (M 1, M n) i kondenzacionog sredstva (KA); 2-linija za snabdevanje reagensima (npr. oksidanti, acilacioni agensi, to-t, itd.) i p-otapala (P 1 , P n); 3 - preklopni ventili; 4-kolona sa medijima, opremljena distribucijom. ventil; 5-fotometrijski ćelija; 6-metar; 7-kontrolna i programska jedinica; 8-displej.
Potencijal sinteze u čvrstoj fazi demonstriran je sintezom ribonukleaze A (R. Merrifield, 1969) i humanog hormona rasta (D. Yamashiro, 1970), dugih 124 i 183 aminokiseline, respektivno. Međutim, zbog male, ali konstantne racemizacije koja se javlja tokom formiranja peptidne veze, sintisajzer. proteini imaju nizak biol. aktivnost, dakle automatska. sintisajzere koristi Ch. arr. za dobijanje kratkih polipeptida (10-30 veza), uključujući i preparativne
Pronalazak se odnosi na metodu čvrste faze za sintezu peptida formule H-D--Nal--Thr-NH2, koji koristi i Boc-zaštićene i Fmoc-zaštićene aminokiseline i hlorometiliranu polistirensku smolu. 10 z.p. f-ly.
Oblast tehnologije kojoj izum pripada
Ovaj pronalazak se odnosi na postupak za pripremu peptida koji sadrži tri ili više aminokiselinskih ostataka, koji imaju N-terminalnu aminokiselinu, pretposljednju aminokiselinu susjednu N-terminalnoj aminokiselini i C-terminalnu aminokiselinu.
Prethodni čl
Sinteza peptida u čvrstoj fazi uvedena je 1963. kako bi se prevazišli mnogi problemi među fazama prečišćavanja povezanih sa sintezom peptida u rastvoru (Stewart et. al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2nd ed., 1984). U sintezi čvrste faze, aminokiseline se sklapaju (npr. spajaju) u peptid u bilo kojoj željenoj sekvenci, dok je jedan kraj lanca (npr. C-terminus) vezan za nerastvorljivi nosač. Jednom kada se željena sekvenca sastavi na nosač (podršku), peptid se zatim oslobađa (tj. cijepa) od nosača. Dvije standardne zaštitne grupe za α-amino grupe aminokiselina koje treba povezati su Boc, koji se uklanja jakom kiselinom, i Fmoc, koji se uklanja bazom. Ovaj pronalazak se odnosi na pogodnu metodu za proizvodnju peptida koristeći kombinaciju obe ove zaštite za α-amino grupe u jednoj sintezi na jeftinoj smoli od hlorometiliranog polistirena.
Prilikom dizajniranja sinteze peptida u čvrstoj fazi korištenjem bilo koje od gornjih šema zaštite α-amino, važno je da sve reaktivne "bočne grupe" aminokiselina koje čine peptid budu zaštićene od neželjenih hemijskih reakcija tokom sklapanja lanca. Takođe je poželjno da hemijske grupe odabrane da zaštite različite bočne grupe ne budu uklonjene reagensima koji se koriste za uklanjanje zaštite β-amino grupa. Treće, važno je da veza rastućeg peptidnog lanca za česticu smole bude otporna na reagense koji se koriste u procesu sklapanja lanca za uklanjanje bilo koje vrste α-amino zaštite. U slučaju α-amino zaštitne sheme koja koristi Fmoc, zaštita bočne grupe mora biti otporna na alkalne reagense koji se koriste za uklanjanje Fmoc. U praksi, ove zaštitne grupe bočnog lanca se obično uklanjaju blago kiselim reagensima nakon što je sklop peptidnog lanca završen. Ako se koristi šema zaštite β-amino grupe koja koristi Boc, zaštita bočne grupe mora biti otporna na slabo kiseli reagens koji se koristi za uklanjanje Boc grupe u svakom ciklusu. U praksi, ove zaštitne grupe bočnog lanca u šemi zaštite β-amino sa Boc-om se obično uklanjaju bezvodnim HF nakon što je sklop peptidnog lanca završen. Stoga, u praksi, uobičajeno korišćene zaštitne grupe bočnog lanca u šemi zaštite α-amino sa Fmoc nisu stabilne pod uslovima koji se koriste za uklanjanje zaštite α-amino grupa sa Boc. Zbog toga se dve vrste zaštitnih šema za α-amino grupe ne kombinuju tokom sastavljanja peptidnog lanca u sintezi peptida u čvrstoj fazi. Osim toga, iako se najjeftinija polimerna smola koja se koristi u sintezi peptida (klorometilirani polistiren ili "Maryfield smola") široko koristi zajedno sa aminokiselinama zaštićenim Boc grupama, u literaturi je zaključeno da nije primjenjiva u slučaju zaštite. α-amino grupa sa Fmoc grupama zbog njegove nestabilnosti u alkalnim uslovima (vidi Stewart et. al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co., 2. izdanje, 1984.). Ovaj pronalazak je usmjeren na metodu za zajedničko korištenje određenih peptida u čvrstoj fazi sinteze i Boc-zaštićenih i Fmoc-zaštićenih aminokiselina na Merifield smoli.
Poznato je da Lanreotide®, koji je analog somatostatina, inhibira oslobađanje hormona rasta, a također inhibira inzulin, glukagon i egzokrinu sekreciju pankreasa.
US Patent br. 4,853,371 otkriva i tvrdi Lanreotide®, proces za njegovu pripremu i metodu za inhibiciju lučenja hormona rasta, insulina, glukagona i egzokrinog lučenja pankreasa.
US Patent br. 5147856 otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje restenoze.
US Patent br. 5411943 otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje hepatoma.
Američki patent br. 5073541 otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje raka pluća.
Američka patentna prijava br. 08/089410, podnesena 9. jula 1993., otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje melanoma.
US patent 5,504,069 otkriva upotrebu Lanreotida® za inhibiciju ubrzanog rasta solidnog tumora.
Američka patentna prijava br. 08/854941, podnesena 13. maja 1997., otkriva upotrebu Lanreotida® za gubitak težine.
Američka patentna prijava br. 08/854,943, podnesena 13. maja 1997., otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje insulinske rezistencije i sindroma X.
Američki patent br. 5688418 otkriva upotrebu Lanreotida® za produženje vitalnosti ćelija pankreasa.
PCT prijava br. PCT/US 97/14154 otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje fibroze.
Američka patentna prijava br. 08/855311, podnesena 13. maja 1997., otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje hiperlipidemije.
Američka patentna prijava br. 08/440061, podnesena 12. maja 1995., otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje hiperamilinemije.
Američka patentna prijava br. 08/852221, podnesena 7. maja 1997., otkriva upotrebu Lanreotida® za liječenje hiperprolaktinemije i prolaktinoma.
Suština pronalaska
Ovaj pronalazak pruža metodu za pripremu peptida koji sadrži tri ili više aminokiselinskih ostataka, koji imaju N-terminalnu aminokiselinu, pretposljednju aminokiselinu susjednu N-terminalnoj aminokiselini i C-terminalnu aminokiselinu, pri čemu navedena metoda uključuje slijedeći koraci:
(a) vezivanje prve aminokiseline na smolu čvrstog nosača eterskom vezom kako bi se formirao prvi proizvod spajanja, što uključuje (i) reakciju vodene otopine cezijevog karbonata s alkoholnom otopinom prve aminokiseline kako bi se formirala cezijeva sol prve amino kiseline, (ii) dobijanje cezijeve soli prve amino kiseline bez otapala, (iii) reakciju čvrste smole nosača sa cezijevom soli prve amino kiseline u suhom (bezvodnom) polarnom aprotičnom otapalu da nastane prvi dodatni proizvod,
gdje prva aminokiselina odgovara C-terminalnoj aminokiselini peptida, amino grupa ne-bočnog (glavnog) lanca prve aminokiseline je blokirana Boc, a prva aminokiselina nema funkcionalnu grupu u bočnom lancu koji zahtijeva zaštitu, a čvrsti nosač - smola - je smola od klorometiliranog polistirena;
(b) uklanjanje zaštite (deblokiranje) Boc sa proizvoda prvog pristupa sa kiselinom da bi se formirao deblokirani proizvod prvog pristupa;
(c) Opciono, spajanje sljedeće amino kiseline na deblokirani prvi proizvod vezivanja, što uključuje reakciju sljedeće amino kiseline sa deblokiranim prvim produktom vezivanja u organskom otapalu koji sadrži reagens za rast peptida kako bi se dobio blokirani (zaštićeni) sljedeći proizvod vezivanja, pri čemu sljedeća aminokiselina u glavnom lancu ima amino grupu blokiranu Boc, a ako sljedeća amino kiselina ima jednu ili više funkcionalnih grupa u bočnom lancu, tada funkcionalne grupe u bočnom lancu ne zahtijevaju zaštitu ili funkcionalne grupe u bočnom lancu imaju zaštitne grupe koje su otporne na kisele ili alkalne reagense koji se koriste za uklanjanje zaštite, Boc i Fmoc;
(d) uklanjanje zaštite Boc od blokiranog sljedećeg adukta, što uključuje reakciju blokiranog sljedećeg adukta s kiselinom da bi se dobio sljedeći adukt bez zaštite;
(e) opciono, ponavljanje koraka (c) i (d), pri čemu svaki ciklus generira oslobođeni proizvod (X+1)-tog sljedećeg pričvršćivanja, gdje je X broj potrebnog ponavljanja ciklusa;
(f) dodavanje sljedeće amino kiseline oslobođenom prvom produktu vezivanja iz koraka (b) ili, opciono, oslobođenom (X+1) sljedećem produktu vezivanja iz koraka (e), što uključuje reakciju sljedeće amino kiseline sa navedenim prvi proizvod vezivanja ili sa navedenim deblokiranim proizvodom (X+1)-og sljedećeg vezivanja u organskom otapalu koji sadrži reagens za uzgoj peptida da bi se dobio blokirani (zaštićeni) sljedeći proizvod vezivanja, a sljedeća aminokiselina ima glavni lanac amino grupa blokirana od strane Fmoc, pod uslovom da ako sljedeća amino kiselina ima jednu ili više funkcionalnih grupa u bočnom lancu, tada funkcionalne grupe u bočnom lancu ne zahtijevaju zaštitu, ili funkcionalne grupe u bočnom lancu imaju zaštitne grupe koje su otporan na alkalne reagense koji se koriste za uklanjanje zaštite od Fmoc;
(g) uklanjanje zaštite Fmoc od blokiranog sljedećeg adukta, što uključuje reakciju blokiranog sljedećeg adukta sa primarnim ili sekundarnim aminom da bi se dobio sljedeći adukt bez zaštite;
(h) opciono, ponavljanje koraka (e) i (g), pri čemu svaki ciklus generira deblokirani proizvod (X+1)-tog sljedećeg sabiranja, gdje je X broj potrebnog ponavljanja ciklusa, do pretposljednjeg uključen je u peptid i deblokiranu aminokiselinu;
(i) vezivanje N-terminalne amino kiseline na deprotecirani (X+1)-ti sljedeći pristupni proizvod, što uključuje reakciju N-terminalne aminokiseline sa deprotektiranim (X+1)-tim sljedećim pristupnim proizvodom u organskom otapalu koji sadrži peptidni reagens za rast, da bi se dobio blokirani krajnji proizvod, pri čemu N-terminalna aminokiselina ima okosnicu amino grupu blokiranu Boc ili Fmoc;
(j) uklanjanje zaštite Boc ili Fmoc sa blokiranog završenog adicionog proizvoda, uključujući reakciju blokiranog završenog adicionog proizvoda sa kiselinom u slučaju Boc ili bazom u slučaju Fmoc da bi se formirao završeni peptidni proizvod na smoli;
(j) ako gotovi peptidni proizvod na smoli ima funkcionalne grupe bočnog lanca, tada opciono uklanjanje zaštite funkcionalnih grupa bočnog lanca završenog peptidnog proizvoda na smoli, što uključuje reakciju završenog peptidnog proizvoda na smoli s odgovarajućim reagensima za uklanjanje zaštite da se dobije gotovi peptidni proizvod na smoli uklonjena zaštita; I
(k) cijepanje peptida od čvrstog smolnog nosača dovršenog peptidnog proizvoda na smoli ili dovršenog peptidnog proizvoda na smoli bez zaštite kako bi se dobio peptid, što uključuje reakciju završenog peptidnog proizvoda na smoli ili završenog peptidnog proizvoda na smoli bez zaštite sa amonijakom , primarni amin ili sekundarni amin do praktičnog završetka cijepanja peptida od smole;
s tim da se koraci (e) i (g) u sintezi peptida moraju izvesti najmanje jednom.
Poželjan je postupak prema ovom izumu gdje je amonijak, primarni amin ili sekundarni amin u koraku (k) u rastvaraču koji sadrži alkohol i opciono aprotično polarno otapalo,
Poželjna je metoda prema ovom izumu, gdje korak (l) dalje uključuje sljedeće korake:
precipitacija odcijepljenog peptida iz rastvarača;
razdvajanje filtracijom čvrste smolne podloge i istaloženog peptida, i
ekstrakcija peptida kiselom otopinom da bi se peptid izolirao.
Poželjna je metoda prema ovom pronalasku, gdje je prva aminokiselina Boc-L-Thr.
Poželjna je metoda prema ovom izumu, gdje je prva aminokiselina cezijeva sol Boc-L-Thr, čime se dobiva Boc-L-Thr smola kao prvi proizvod kuplovanja, a deblokirani prvi spojni proizvod je H-L-Thr smola .
Poželjan je postupak iz ovog pronalaska u kojem je kiselina koja se koristi za uklanjanje Boc zaštitne grupe u koraku(ovima) trifluorosirćetna kiselina (TFA).
Poželjna metoda, koja se odnosi na neposredno prethodni proces, je kada je organski rastvarač metilen hlorid, hloroform ili dimetilformamid, a reagens za rast peptida je diizopropilkarbodiimid, dicikloheksilkarbodiimid ili N-etil-N"-(3-dimetil-aminopropil)karbodiimid .
Poželjna metoda, koja se odnosi na neposredno prethodnu metodu, je metoda koja se sastoji od izvođenja koraka (e) i (g) šest puta nakon formiranja deblokiranog prvog spojnog produkta formule H-L-Thr-smole, gdje su sljedeće aminokiseline priloženi redoslijedom: Fmoc-L-Cys( Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) i Fmoc-L- Cys(Acm) za formiranje proizvoda H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-smola.
Poželjna metoda, koja se odnosi na neposredno prethodnu metodu, je metoda koja se sastoji od dodavanja Boc-D--Nal u H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val- Cys(Acm) -Tnr-smola prema koraku (c) za dobijanje Boc-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Ast) -Thr-smola.
Poželjna metoda, koja se odnosi na neposredno prethodnu metodu, uključuje istovremeno uklanjanje Boc grupe koja štiti D--Nal, O-t-Bu grupe koja štiti Tyr i Boc grupe koja štiti Lys u Boc-D--Nal-Cys(Acm )-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-smola prema koraku (i), da se dobije gotov peptidni proizvod na smoli formule H-D- - Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-smola.
Poželjna metoda, koja se odnosi na neposredno prethodnu metodu, uključuje cijepanje H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr peptida iz čvrste smole izvođenjem reakcija H-D-βNal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-smola sa amonijakom u rastvaraču koji sadrži alkohol i opciono aprotično polarno otapalo do suštinski potpune eliminacije da bi se dobio H-D --Nal-Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 .
Poželjni proces, povezan s neposredno prethodnim procesom, je gdje je alkohol metanol, a polarni aprotični rastvarač je dimetilformamid.
Poželjna metoda, koja se odnosi na neposredno prethodnu metodu, uključuje istovremeno uklanjanje Acm zaštitnih Cys grupa i ciklizaciju rezultirajućih deproteciranih Cys ostataka u završenom peptidnom proizvodu formule H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D -Trp-Lys-Val -Cys(Acm)-Thr-NH 2 provođenjem reakcije H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 sa rastvorom joda u alkoholu do skoro potpunog uklanjanja zaštite i ciklizacije da bi se dobio H-D--Nal--Thr-NH2.
Poželjna metoda, povezana sa neposredno prethodnom metodom, je metoda u kojoj je peptid H-D--Nal--Thr-NH2.
Poželjna metoda, povezana sa neposredno prethodnom metodom, je ona u kojoj je peptid analog somatostatina.
Termini korišćeni u opisu ovog pronalaska su definisani na sledeći način:
"prva aminokiselina": obuhvaća bilo koju aminokiselinu u kojoj je amino grupa u glavnom lancu (ne u bočnom lancu) zaštićena Boc-om, koji je komercijalni proizvod ili se može sintetizirati prema metodama poznatim osobi uobičajenih vještina u struci, na primjer Boc-L-Thr;
"prvi proizvod vezivanja": opisuje proizvod koji je vezan za čvrstu smolu nosača koja je rezultat dodavanja prve amino kiseline čvrstoj smoli nosača, npr. Boc-L-Thr smola;
"deblokirani prvi spojni proizvod": opisuje proizvod koji nastaje uklanjanjem ili uklanjanjem Boc grupe iz prvog spojnog proizvoda - na primjer, H-L-Thr-smola, gdje je "H" dostupni vodik amino grupe glavne lanac, koji je rezultat koraka uklanjanja zaštite;
"sljedeća aminokiselina": opisuje bilo koju aminokiselinu u kojoj je amino grupa u glavnom lancu zaštićena Boc ili Fmoc, koja je komercijalno dostupna ili se može sintetizirati prema metodama poznatim prosečnom stručnjaku. Budući da korak (c) i korak (e) mogu biti uključeni u ciklus koji se ponavlja gdje se korak izvodi više od jednom, svaki vremenski korak (c) ili korak (e) se izvodi, "sljedeća aminokiselina" može se nezavisno odabrati između grupa aminokiselina za koju se zna ili je vjerovatno da će biti sintetizirana u kojoj je amino grupa u glavnom lancu zaštićena Boc ili Fmoc;
"blokirani proizvod (X+1)-tog sljedećeg pristupa": opisuje proizvod vezan za čvrstu smolu nosača, što je rezultat veze sljedeće amino kiseline sa "deblokiranim proizvodom sljedećeg pristupa". Budući da se koraci (c) i (d) i koraci (e) i (g) mogu uključiti u ciklus koji se ponavlja u koji se mogu vezati sljedeće aminokiseline, termin "blokirani proizvod (X+1)-og sljedećeg vezivanja" odnosi se na proizvod dobiven kao rezultat svakog od prethodnih ciklusa pristupanja;
"deblokirani proizvod (X+1)-tog sljedećeg pristupa": opisuje proizvod koji je rezultat uklanjanja Fmoc grupe iz "blokiranog proizvoda (X+1)-tog sljedećeg pristupa";
"dovršeni peptidni proizvod na smoli": opisuje peptidni proizvod vezan za čvrstu smolu za potporu nakon što je N-terminalna aminokiselina vezana na peptidni lanac i nakon što je amino grupa N-terminalne aminokiselinske kičme uklonjena ili deblokirana , ali koji i dalje ima bilo kakve zaštitne grupe na funkcionalnim grupama bočnih lanaca, koje nisu uklonjene reakcijom, vršeći uklanjanje zaštitne grupe iz glavnog lanca N-terminalne amino kiseline; I
"dovršeni peptidni proizvod na smoli bez zaštite": opisuje peptidni proizvod vezan za čvrsti nosač smole gdje su sve zaštitne grupe uklonjene ili uklonjene sa funkcionalnih grupa bočnih lanaca aminokiselina.
Primjeri kiselina koje se mogu koristiti za uklanjanje zaštite Boc-a su trifluorosirćetna kiselina (TFA), metansulfonska kiselina i organski rastvori koji sadrže HCl.
Primjeri primarnih i sekundarnih amina koji se mogu koristiti za uklanjanje zaštite Fmoc su 4-(aminometil)piperidin, piperidin, dietilamin, DBU i tris(2-aminoetil)amin.
Primjeri nenukleofilnih baza koje se mogu koristiti za neutralizaciju TFA soli oslobođenih amino grupa (RNH 3 + CF 3 COO - ove soli moraju biti pretvorene u "slobodne" amine (NH 2) prije ili za vrijeme dodavanja sljedeće aminokiseline , inače do dodavanja neće doći) su diizopropiletilamin (DIEA) i trietilamin (TEA).
Primjeri organskih rastvarača koji se mogu koristiti u reakcijama dodavanja aminokiselina su metilen hlorid, hloroform, dihloretan, dimetilformamid, dietilacetamid, tetrahidrofuran, etil acetat, 1-metil-2-pirolidon, acetonitril ili kombinacija ovih rastvarača.
Primjeri peptidnih produljivača uključuju supstituirane karbodiimide kao što su: diizopropilkarbodiimid, dicikloheksilkarbodiimid ili N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid.
Karboksilne grupe i amino grupe koje učestvuju u formiranju peptidne amidne veze nazivaju se karboksilnom grupom "bočnog lanca", odnosno amino grupom. S druge strane, sve funkcionalne grupe aminokiselina koje ne učestvuju u formiranju peptidne amidne veze nazivaju se funkcionalnim grupama "bočnog lanca".
Izraz "grupa otporna na baze" odnosi se na zaštitne grupe koje se koriste za zaštitu funkcionalnih grupa aminokiselina koje (1) su otporne na baze, npr., ne mogu se ukloniti bazama kao što su 4-(aminoetil)piperidin, piperidin ili tris(2 -aminoetil)amin, koje su baze koje se obično koriste za uklanjanje Fmoc zaštitne grupe, i (2) mogu se ukloniti kiselinom kao što je trifluorosirćetna kiselina ili drugim metodom kao što je katalitička hidrogenacija.
Simboli "Fmoc" i "Boc" se koriste ovdje iu pratećoj formuli za označavanje 9-fluorenilmetoksikarbonil i t-butiloksikarbonil, respektivno.
Gore opisana metoda može se koristiti za pripremu peptida, poželjno analoga somatostatina, kao što je Lanreotide® oktapeptid, koji ima sljedeću formulu: H-D--Nal--Thr-NH2. Ako treba sintetizirati H-D--Nal--Thr-NH2, zaštitne grupe otporne na baze koje se koriste za zaštitu funkcionalnih grupa Cys, Lys i Tyr bočnog lanca mogu biti acetamidometil (Acm), Boc i terc-butil, respektivno. Asm se preferira u odnosu na Cys.
Pod analogom somatostatina podrazumijeva se peptid koji pokazuje biološku aktivnost sličnu (tj. agonistu) ili suprotnu (tj. antagonistu) onoj kod somatostatina.
U formuli H-D--Nal--Thr-NH2, svaki od uobičajenih troslovnih simbola aminokiselina (npr. Lys) odnosi se na strukturni aminokiselinski ostatak. Na primjer, simbol Lys u gornjoj formuli predstavlja -NH-CH((CH 2) 4 NH 2)-CO-. Simbol D- -Nal- predstavlja aminokiselinski ostatak D-2-naftilalanil. Zagrade označavaju disulfidnu vezu koja povezuje slobodne tiole dva Cys ostatka u peptidu, što ukazuje da aminokiseline peptida unutar zagrada formiraju ciklus.
Na osnovu ovde datog opisa, osoba koja je iskusna u ovoj oblasti će biti u stanju da najpotpunije koristi ovaj pronalazak.
Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju isto značenje koje obično razumeju oni koji su uobičajeni u struci na koju se ovaj pronalazak odnosi. Osim toga, sve publikacije, prijave patenata, patenti i druge reference ovdje citirane su ovdje uključene referencom na njih.
Peptid se može pripremiti u skladu sa metodom ovog pronalaska prema sledećoj proceduri.
Otopina od 0,5 molarnih ekvivalenata cezijevog karbonata u vodi polako se dodaje u otopinu od 1 molarnog ekvivalenata Boc-AA 1 (Bachem California, Torrance, CA) gdje AA 1 odgovara C-terminalnoj aminokiselini otopljenoj u alkoholu, poželjno metanol. Rezultirajuća smjesa je miješana oko 1 sat na sobnoj temperaturi, zatim su sav alkohol i sva voda uklonjeni pod sniženim pritiskom da bi se dobio suvi prah Boc-AA 1 cezijum soli. Merifield smola, 1,0 ekvivalenta (klor-metilirani polistiren, 200-400 mesh, inkorporacija hloridnih jona 1,3 meq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky ili Polymer Laboratories, Church Stretton, Engleska) se ispere s hloriranim dihlorom otapalom, po mogućnosti ), alkohol, poželjno metanol, i polarni aprotični rastvarač, poželjno dimetilformamid (DMF). Cezijum soli Boc-AA 1 u prahu se rastvori u bezvodnom (suvom) polarnom aprotičnom rastvaraču, poželjno DMF, i rastvor se kombinuje sa prethodno ispranom smolom. Suspenzija se lagano miješa na oko 45°-65°C, poželjno na 50°-60°C, oko 48 do 106 sati, poželjno 85 do 90 sati, u inertnoj atmosferi kao što je dušik. Smola se odvoji filtracijom i temeljito ispere polarnim aprotičnim rastvaračem, poželjno DMF, vodom i na kraju alkoholom kao što je MeOH. Boc-AA 1 smola se suši pod sniženim pritiskom.
Boc-AA 1 -smola se unosi u stakleni reaktor sa dnom filtera od grubog topljenog stakla. Smola se ispere hlorisanim rastvaračem kao što je DCM, deblokira se organskom kiselinom, poželjno 25% TFA u DCM, nakratko se ispere hlorisanim rastvorom kao što je DCM i alkoholom kao što je MeOH, neutrališe se organskom bazom, poželjno trietilaminom u DCM, i ponovo ispran sa DCM i polarnim aprotičnim rastvaračem kao što je DMF da bi se dobila AA 1 smola bez zaštite.
Bilo koji željeni broj aminokiselina se tada opciono vezuje za AA 1 smolu bez zaštite. Ako sljedeća aminokiselina ima α-amino grupu sa Fmoc zaštitom (Fmoc-AA x), tada grupa bočnog lanca ili ne zahtijeva zaštitu (na primjer, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Phe ili Fmoc- Thr) ili bočni lanac štiti grupom otpornom na bazu. Molarni višak Fmoc-AA x (gdje je x broj pozicije aminokiseline u peptidu, računajući od C-terminusa) je vezan na otprilike 60 minuta na AA 1 smolu bez zaštite pomoću reagensa za rast peptida kao što je diizopropilkarbodiimid (DIC), u mješavini DCM/DMF. Dodatna smola je isprana sa DMF, alkoholom i DCM da bi se dobila Fmoc-AA x -AA 1 smola. Vezanost se može provjeriti metodom Kaiser ninhidrina. Zatim se Fmoc-AA x -AA 1 smola jednom ispere sa DMF-om, a zatim deblokira rastvorom baze u organskom rastvaraču kao što je piperidin u DMF-u da se dobije AA x -AA 1 smola. AA x -AA 1 smola se zatim ispere sa DMF-om, nakon čega se ispire nekoliko puta sa alkoholom kao što je MeOH i DCM. AA x -AA 1 smola se zatim ispere jednom sa DMF oko 3 minuta, tri puta sa izopropanolom, poželjno oko 2 minuta svaki put, i tri puta sa DCM, poželjno oko 2 minuta svaki put. Smola je tada spremna za dalje vezivanje ili Fmoc-zaštićene amino kiseline kao što je gore opisano ili Boc-zaštićene aminokiseline kao što je opisano u nastavku.
Slično, ako je bilo koja naredna aminokiselina koja se vezuje za deprotektiranu AA 1 smolu odabrana sa zaštićenom Boc-amino grupom (Boc-AA x), tada nije potrebna zaštita za grupu bočnog lanca (ovo može biti Boc-Gly , Boc-Ala, Boc-Phe ili Boc-Thr), ili bočni lanac mora biti zaštićen grupom otpornom na uklanjanje i kiselinom i bazom, što može biti Boc-Cys(Acm). Ako je odabran Boc-AA x, on se pričvršćuje korištenjem istih reagensa i rastvarača kao što je gore opisano za Fmoc-amino kiseline, a potpunost (završetak) vezivanja može se provjeriti Kaiser ninhidrin metodom. Nakon toga, Boc-AA x -AA 1 smola je deprotektovana rastvorom kiseline u organskom rastvaraču kao što je TFA u DCM da bi se dobila CF 3 CO - H + -AA x -AA 1 smola. Ova smola se zatim nekoliko puta ispere s kloriranim rastvaračem kao što je DCM, alkoholom kao što je MeOH, i neutralizira se nenukleofilnom bazom kao što je trietilamin u DCM-u, a zatim se još nekoliko puta ispere s kloriranim rastvaračem kao što je DCM da se dobije AA x -AA 1 - smola. Smola je tada spremna za dalje vezivanje zaštićene Boc ili Fmoc amino kiseline kao što je gore opisano.
U zavisnosti od željene sekvence peptida i tipa α-amino zaštićene aminokiseline koja se koristi (bilo zaštićena Fmoc ili zaštićena Boc), koristi se odgovarajuća kombinacija gornjih postupaka vezivanja, ovisno o tome koja aminokiselina će se pojaviti u peptidna sekvenca - bočni lanac, koji ima zaštitnu grupu koja se može ukloniti bilo bazom potrebnom za uklanjanje Fmoc iz α-amino grupe, ili kiselinom potrebnom za uklanjanje Boc iz α-amino grupe. Takva zaštićena aminokiselina može biti N-β-Boc-N″-β-Fmoc-lizin ili N-β-Fmoc-N″-β-Boc-lizin. Ako je to slučaj, sve zaštitne grupe koje se mogu birati za α-amino grupe narednih aminokiselina, do N-terminalne aminokiseline, moraju biti kompatibilne sa zaštitom bočne grupe odabranom za tu poziciju. To znači da zaštitne grupe bočnog lanca moraju biti otporne na sredstvo za uklanjanje blokada koje se koristi za uklanjanje zaštite α-amino grupa narednih amino kiselina. Za N-terminalnu aminokiselinu, Boc ili Fmoc se mogu koristiti kao α-amino zaštita, budući da uklanjanje zaštite N-terminalne aminokiseline može istovremeno ukloniti zaštitu nekih od zaštićenih bočnih lanaca bez nepoželjnog utjecaja na strategiju sinteze peptida, jer nema aminokiseline su više dostupne.
Završeni peptidni lanac, koji je još uvijek vezan za smolu, mora biti uklonjen i oslobođen. Da bi se uklonile sve zaštitne grupe otporne na baze i α-amino blokirajuća grupa N-terminalne amino kiseline, ako je primjenjivo, peptid na smoli se tretira kiselinom u organskom rastvaraču kao što je TFA u DCM. Da bi se uklonile sve zaštitne grupe otporne na kiselinu i α-amino blokirajuća grupa N-terminalne aminokiseline, ako je primjenjivo, peptid na smoli se tretira organskom bazom kao što je piperidin u DMF-u. Alternativno, grupe otporne na kiselinu mogu se zadržati dok se ne uklone nakon naknadnog cijepanja peptida amonijakom ili bazom amina. Peptid na smoli bez zaštite je zatim ispran hlorisanim rastvaračem kao što je DCM, alkoholom kao što je MeOH i osušen do konstantne težine pod sniženim pritiskom.
Peptid se odvaja od smole i C-terminus se pretvara u amid suspendovanjem peptida na smoli u 3:1 MeOH/DMF. Suspenzija se ohladi na temperaturu ispod oko 10°C u atmosferi azota, a bezvodni gasoviti amonijak se uvodi ispod površine rastvarača dok se rastvor ne zasiti njime, dok se temperatura održava ispod oko 10°C. Suspenzija se lagano miješa oko 24 sata uz ostavljanje temperature na oko 20°C. Stepen završetka reakcije se proverava nestankom intermedijera metil estra u HPLC pod pogodnim uslovima u zavisnosti od tipa peptida. reakcijska smjesa ohladite i dodajte potrebnu količinu bezvodnog amonijaka dok HPLC površina vrha koja odgovara metil esteru ne bude manja od 10% površine pika ciljnog proizvoda. Suspenzija je ohlađena na ispod oko 10°C i miješanje je nastavljeno preko noći da se istaloži peptid. Talog i smola se odvoje filtracijom i isperu sa hladnim MeOH. Precipitat i smola se osuše pod sniženim pritiskom, proizvod se ekstrahuje iz smole vodenim rastvorom sirćetne kiseline.
Ako peptid sadrži zaštićene Cys ostatke u svojoj sekvenci, tiol grupe se mogu ukloniti, a ostaci ciklizirati prema sljedećoj proceduri. Peptid koji sadrži zaštićene Asm grupe Cys se rastvara u vodenom rastvoru sirćetne kiseline u atmosferi azota. Rastvor se brzo meša i u jednom obroku se dodaje rastvor joda u alkoholu. Smeša je promešana i proverena pomoću HPLC za potpunu deprotekciju. Zatim se reakcija zaustavlja titracijom sa 2% rastvorom natrijum tiosulfata dok boja rastvora ne nestane. Sirova smeša je prečišćena preparativnom hromatografijom na C8 kertridžu sa gradijentom acetonitrila u 0,1 amonijum acetatnom puferu, desoljena na C8 kertridžu sa gradijentom acetonitrila u 0,25 N sirćetnoj kiselini, i liofilizovana da bi se dobio ciljni peptid.
Primer izvođenja pronalaska
Sljedeći primjer je dat da ilustruje metodu ovog pronalaska i ne treba se tumačiti kao ograničavajući njegov obim.
Primjer 1. H 2 -D- -Nal--Thr-NH 2
A) Boc-L-Thr-smola
Rastvor od 2,58 g cezijum karbonata u 2,5 ml vode polako je dodavan u rastvor od 3,48 g Boc-L-treonina (Bachem California, Torrance, CA) rastvorenog u 7 ml metanola. Rezultirajuća smjesa je miješana približno 1 sat na sobnoj temperaturi, zatim su sav metanol i sva voda uklonjeni pod sniženim tlakom da bi se dobio suvi prah Boc-L-treonin cezijum soli. 10 g Maryfield smole (klorometilirani polistiren, 200-400 mesh, inkorporacija hlora 1,3 meq/g, Advanced ChemTech, Louisville, Kentucky) isprano je dihlorometanom (DCM), metanolom (MeOH) i dimetilformamidom (DMF) puta 7e0 ml). Boc-L-treonin cezijum soli u prahu je rastvoren u 60 ml suvog DMF-a i rastvor je kombinovan sa smolom ispranom kao što je gore navedeno. Suspenzija je lagano miješana na temperaturi od približno 50°-60°C približno 85 do 90 sati u atmosferi dušika. Smola je odvojena filtracijom i dobro isprana sa DMF, dejonizovanom vodom i konačno sa MeOH. Boc-treonin smola je osušena pod sniženim pritiskom na približno 40°C. Uključenost treonina bila je 0,85±0,15 meq/g suhe smole.
B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-smola
2,0 g Boc-treonin smole iz koraka (A) uvedeno je u stakleni reaktor od 50 ml sa dnom filtera od grubog topljenog stakla (opterećenje 1,74 mmol). Smola je isprana 2 puta sa DCM (20 ml), svaki put oko 5 minuta, deblokirana sa 25% TFA u DCM (30 ml) - prvi put oko 2 minuta i drugi put oko 25 minuta, isprana 3 puta za oko 2 min DCM (20 ml), izopropanol (20 ml) i DCM (20 ml), neutralizovan dva puta po oko 5 min sa 10% trietilamina u DCM (20 ml), ispran 3 puta po oko 2 min sa DCM i jednom isprati sa DMF (20 ml) oko 5 min.
U deblokiranoj smoli dodano je 1,8 g (4,35 mmol, 2,5 ekv.) Fmoc-L-cistein(Acm) (Bachem, Kalifornija) i 683 μl (4,35 mmol, 2,5 ekv.) diizopropilkarbodiimida (DIC) u 1 ml 2:1 DCM/DMF otprilike 1 sat Nakon dodavanja, smola je isprana jednom oko 3 minute sa DMF (20 ml), 3 puta oko 2 minuta sa 2 min DXM (20 ml). Vezivanje je provjereno metodom Kaiser nihidrina.
Nakon pričvršćivanja, smola je 1 put isprana sa DMF-om, a zatim deblokirana rastvorom piperidina u DMF-u. Deblokirana smola je zatim isprana sa DMF i isprana nekoliko puta istovremeno sa MeOH i DCM. Smola za spajanje je isprana 1 put oko 3 minuta sa DMF (20 ml), 3 puta po oko 2 minuta sa izopropanolom (20 ml) i 3 puta sa DCM (20 ml) po oko 2 minuta svaki put. Vezivanje je testirano Kaiser ninhidrinskom metodom.
Svaka od sljedećih zaštićenih aminokiselina je spojena na ispranu smolu korištenjem DIC u DMF/DCM i otpuštena kako je gore opisano u sljedećem nizu: Fmoc-L-valin, Fmoc-L-lizin (Boc), Fmoc-D-triptofan, Fmoc-L-tirozin (O-t-Bu) i Fmoc-L-cistein (Acm) (svi iz Bachem California), Boc-D-2-naftilalanin (Synthech, Albany, OR).
Završeni peptidni lanac je deblokiran i zaštićen dva puta sa 75:20:5 DCM/TFA/anizol (30 ml) oko 2 minuta i oko 25 minuta, ispran 3 puta po oko 2 minuta svaki put sa DCM (20 ml), izopropanolom (10 ml) i DCM (20 ml), neutralizirano 2 puta po oko 5 min sa 10% trietilamina u DCM (20 ml) i isprano 3 puta oko 2 min sa DCM (20 ml) i MeOH (20 ml). Smola je osušena pod sniženim pritiskom. Suha težina je 3,91 g (103% od teoretskog prinosa).
B) H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2
2,93 g smole napunjene peptidima iz koraka (B) (1,3 mmol-ekv.) suspendovano je u 50 ml 3:1 mešavine MeOH/DMF. Suspenzija je ohlađena na temperaturu ispod oko 10°C u atmosferi azota i suvi gasoviti amonijak je propuhan dok rastvor nije bio zasićen njime, dok je temperatura održavana ispod oko 10°C. Suspenzija je lagano miješana oko 24 sata, dozvoljavajući da temperatura poraste na oko 20°C. Stepen završetka reakcije je provjeren nestankom intermedijera metil estra pomoću HPLC (VYDAC® sorbent, veličina zrna 5 μm, veličina pora 100 Å, C18, eluiranje pod izokratskim uslovima 26% CH 3 CN u 0,1% TFA, brzina 1 ml/min, snimanje na 220 mm; pod ovim uslovima, vreme retardacije Rt ~ 14 min za metil ester i ~ 9,3 min za amidni proizvod). Reakciona smjesa je ohlađena i dodat je višak bezvodnog amonijaka sve dok površina pika koja odgovara metil esteru na HPLC nije bila manja od 10% površine pika željenog proizvoda. Suspenzija je ohlađena na temperaturu ispod približno 10°C, miješanje je nastavljeno preko noći da se istaloži peptid. Precipitat i smola su odvojeni filtracijom i isprani sa 15 ml hladnog MeOH. Precipitat i smola su osušeni pod sniženim pritiskom, proizvod je ekstrahovan iz smole sa 50% vodenim rastvorom sirćetne kiseline (3 x 30 ml). HPLC analiza je pokazala 870 mg (0,70 mmol) naslovnog proizvoda u smeši (96% čistoće u izokratskom HPLC sistemu).
D) H-D- -Nal--Thr-NH 2
500 mg (0,40 mmol) peptida iz koraka (B) je rastvoreno u 300 ml 4% sirćetne kiseline i zagrejano na oko 55°C pod azotom. Rastvor je brzo mešan i u jednom obroku je dodan 2% w/v rastvor joda u 7,7 ml MeOH (0,60 mmol). Smjesa je miješana približno 15 min, a zatim je reakcija zaustavljena titracijom sa 2% rastvorom natrijum tiosulfata dok boja ne nestane (~2 ml). Smjesa je ohlađena do sobnoj temperaturi i filtriran. Smjesa je pročišćena preparativnom hromatografijom na C8 koloni (YMC, Inc., Wilmington, NC) sa gradijentom acetonitrila u 0,1 M amonijum acetatu, desoljena na C8 YMC koloni sa gradijentom acetonitrila u 0,25 N sirćetnoj kiselini, i liofilizirano da bi se dobilo 350 mg ciljnog peptida u 99% čistoće.
Na osnovu gornjeg opisa, osoba verzirana u struku može lako prepoznati bitne karakteristike ovog pronalaska i, bez odstupanja od njegovog duha i obima, napraviti razne izmjene i modifikacije pronalaska kako bi ga prilagodila različitim primjenama i uslovima. Stoga su i druge realizacije pronalaska takođe pokrivene patentnim zahtjevima.
TVRDITI
1. Metoda za pripremu peptida formule H-D--Nal--Thr-NH2, pri čemu navedena metoda uključuje sljedeće korake:
(a) vezivanje prve aminokiseline na smolu čvrstog nosača eterskom vezom kako bi se formirao "prvi proizvod spajanja", što uključuje (i) reakciju vodene otopine cezijevog karbonata s alkoholnom otopinom prve aminokiseline kako bi se formirao cezijeva sol prve amino kiseline, (ii) dobivanje cezijeve soli prve aminokiseline bez otapala, (iii) reagiranje čvrste smole nosača sa cezijevom soli prve amino kiseline u bezvodnom polarnom aprotičnom otapalu da se formira "prvi dodatak proizvod",
pri čemu je prva aminokiselina Boc-L-Thr, što odgovara C-terminalnoj aminokiselini ovog peptida, a smola čvrstog medija je smola od klorometiliranog polistirena;
(b) uklanjanje zaštite Boc od prvog dodanog produkta kiselinom kako bi se formirao "proizvod prvog dodavanja bez zaštite";
(c) Opciono, dodavanje "sljedeće amino kiseline" "deblokiranom prvom proizvodu vezivanja" što uključuje reakciju "sljedeće amino kiseline" sa "deblokiranim prvim proizvodom vezivanja" u organskom otapalu koji sadrži reagens za rast peptida kako bi se dobio "blokirani sljedeći aminokiselinski proizvod". dodatak", a "sljedeća aminokiselina" ima amino grupu koju blokira Boc u glavnom lancu, a ako ova "sljedeća aminokiselina" ima jednu ili više funkcionalnih grupa u bočnom lancu, tada funkcionalne grupe u bočnom lancu ne zahtevaju zaštitu ili ove funkcionalne grupe u bočnom lancu imaju zaštitne grupe koje su stabilne na kisela ili alkalna sredstva za uklanjanje zaštite, Boc i Fmoc;
(d) uklanjanje zaštite Boc-a od "sljedećeg blokiranog proizvoda" što uključuje reakciju "sljedećeg blokiranog proizvoda" s kiselinom kako bi se dobio "deblokirani sljedeći proizvod";
(e) opciono, ponavljanje koraka (c) i (d), sa svakim ciklusom koji proizvodi "deblokirani proizvod (X+1)-tog sljedećeg priključka", gdje je X broj željenih ponavljanja ciklusa;
(e) dodavanje "sljedeće amino kiseline" "deblokiranom proizvodu prve veze" iz koraka (b) ili, opciono, "deblokiranom proizvodu (X+1) sljedeće veze" iz koraka (e), što uključuje provođenje reakcije "sljedeća aminokiselina" sa navedenim "deblokiranim proizvodom prvog vezivanja" ili sa navedenim "deblokiranim proizvodom (X + 1)-og sljedećeg spoja" u organskom otapalu koji sadrži reagens za uzgoj peptida da se dobije "blokirani proizvod sljedećeg vezivanja", a ova "sljedeća aminokiselina" ima Fmoc blokiranu amino grupu glavnog lanca, pod uvjetom da ako ta "sljedeća aminokiselina" ima jednu ili više funkcionalnih grupa u bočnom lancu, tada funkcionalne grupe u bočnom lancu ne zahtijevaju zaštitu, ili funkcionalne grupe u bočnom lancu imaju zaštitne grupe koje su otporne na alkalne reagense koji se koriste za uklanjanje zaštite Fmoc;
(g) uklanjanje zaštite sa "blokiranog sljedećeg proizvoda" Fmoc, što uključuje reakciju "sljedećeg blokiranog proizvoda" s primarnim ili sekundarnim aminom da bi se dobio "deblokirani sljedeći proizvod";
(h) opciono, ponavljanje koraka (e) i (g), pri čemu svaki ciklus proizvodi "deblokirani proizvod (X+1)-tog sljedećeg priloga", gdje je X željeni broj ponavljanja ciklusa dok se ne uključe u oslobađa se peptid i pretposljednja aminokiselina;
(i) dodavanje N-terminalne aminokiseline "deblokiranom proizvodu (X+1)-tog sljedećeg pristupa", što uključuje reakciju N-terminalne amino kiseline sa "deblokiranim proizvodom (X+1)-og sljedećeg pridruživanje" u organskom rastvaraču koji sadrži reagens za produžavanje peptida da bi se formirao "blokirani kompletan proizvod vezivanja" pri čemu "N-terminalna aminokiselina" ima amino grupu blokiranu Boc ili Fmoc;
(j) uklanjanje zaštite Boc ili Fmoc od "blokiranog završenog proizvoda" koje uključuje reakciju "blokiranog završenog proizvoda" sa kiselinom u slučaju Boc ili bazom u slučaju Fmoc da bi se formirao gotov peptidni proizvod na smoli;
(j) ako "peptidni proizvod okončan smolom" ima funkcionalne grupe bočnog lanca, tada opcionalno uklanjanje zaštite funkcionalnih grupa bočnog lanca "peptidnog proizvoda završenog smolom", što uključuje reakciju "peptidnog proizvoda završenog smolom" s odgovarajućim reagensima za uklanjanje zaštite proizvesti "potpuni peptidni proizvod na smoli bez zaštite"; I
(k) cijepanje peptida od čvrstog smolnog nosača "gotovog peptidnog proizvoda na smoli" ili "finaliziranog peptidnog proizvoda na smoli bez zaštite" kako bi se dobio peptid, što uključuje reakciju "gotovog peptidnog proizvoda na smoli" ili "gotovog peptidnog proizvoda na smoli" smola"; smola sa deprotekcijom" sa amonijakom, primarnim aminom ili sekundarnim aminom sve dok se odvajanje peptida od smole ne završi gotovo;
pod uslovom da se koraci (e) i (g) u sintezi peptida izvode šest puta nakon formiranja "deblokiranog proizvoda prvog vezivanja" formule H-L-Thr-smole, gdje su sljedeće aminokiseline vezane u redoslijed: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc -L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) i Fmoc-L-Cys( Acm) da formira H-Cys(Acm)-Tyr (O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-smolu.
2. Metoda prema zahtjevu 1, naznačena time što je amonijak, primarni amin ili sekundarni amin u koraku (k) u rastvaraču koji sadrži alkohol i opciono aprotonsko polarno rastvarač.
3. Metoda prema zahtjevu 1, gdje korak (l) dalje uključuje sljedeće korake:
(i) taloženje odcijepljenog peptida iz rastvarača;
(ii) filtriranje čvrstog nosača smole i istaloženog peptida, i
(iii) ekstrakcija peptida kiselim rastvorom da bi se peptid izolovao.
4. Metoda prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 3, naznačena time što je prva aminokiselina cezijeva sol Boc-L-Thr, koja daje Boc-L-Thr smolu kao prvi proizvod spajanja, i "deblokirani prvi proizvod spajanja "je H-L-Thr -smola.
5. Metoda prema zahtjevu 4, naznačena time što je kiselina koja se koristi za uklanjanje Boc zaštitne grupe u koraku (i) trifluorosirćetna kiselina (TFA).
6. Metoda prema zahtjevu 5, naznačena time što je organski rastvarač metilen hlorid, hloroform ili dimetilformamid, a reagens za rast peptida je diizopropilkarbodiimid, dicikloheksilkarbodiimid ili N-etil-N"-(3-dimetil-aminopropil)karbodiimid.
7. Metoda prema patentnom zahtjevu 6, koja uključuje vezivanje Boc-D--Nal-a na H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-smolu prema koraku (i) da se dobije Boc-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-smola.
8. Metoda prema zahtjevu 7, koja se sastoji od istovremenog uklanjanja Boc grupe koja blokira D- -Nal, O-t-Bu grupe koja štiti Tyr i Boc grupe koja štiti Lys u Boc-D- -Nal-Cys(Acm)- Tyr(O-t -Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-smola, prema koraku (d) da se dobije gotov peptidni proizvod na smoli formule H-D--Nal-Cys (Acm)-Tyr-D -Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-smola.
9. Metoda prema patentnom zahtjevu 8, koja uključuje cijepanje peptida H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr iz čvrste smole provođenjem reakcije H-D- -Nal-Cys( Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-smola sa amonijakom u rastvaraču koji sadrži alkohol i opciono aprotično polarno otapalo do suštinski potpune eliminacije da bi se dobio H-D--Nal -Cys (Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 .
10. Postupak prema zahtjevu 9, naznačen time što je alkohol metanol, a polarni aprotični rastvarač je dimetilformamid.
11. Metoda prema zahtjevu 10, koja se sastoji od istovremenog uklanjanja Acm grupa koje štite Cys i cikliziranja rezultirajućih deprotektiranih Cys ostataka u "potpuni peptidni proizvod na smoli" formule H-D--Nal-Cys(Acm)-Tyr-D -Trp- Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 provođenjem reakcije H-D- -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH 2 sa rastvorom joda u alkoholu da bi se suštinski završilo uklanjanje zaštite i ciklizacija da bi se dobio H-D--Nal--Thr-NH2.
